WO2008006536A1 - Gat1-assay - Google Patents

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WO2008006536A1
WO2008006536A1 PCT/EP2007/006073 EP2007006073W WO2008006536A1 WO 2008006536 A1 WO2008006536 A1 WO 2008006536A1 EP 2007006073 W EP2007006073 W EP 2007006073W WO 2008006536 A1 WO2008006536 A1 WO 2008006536A1
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WO
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active substance
complex
medium
protein
gat1
Prior art date
Application number
PCT/EP2007/006073
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English (en)
French (fr)
Inventor
Natalie Watzke
Kerstin Diekert
Renate Gauss
Petr Obrdlik
Maarten Ruitenberg
Wolfgang Dörner
Bela Kelety
Original Assignee
Iongate Biosciences Gmbh
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Filing date
Publication date
Application filed by Iongate Biosciences Gmbh filed Critical Iongate Biosciences Gmbh
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
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    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the invention relates to a GATl assay, and more particularly to a method of identifying substances that affect the transport activity of GAT-I or GATl.
  • the invention further relates to an active substance complex which has been or has been identified according to the method according to the invention, a method for producing a drug, a test kit for carrying out the method according to the invention, a screening method and the uses of the method according to the invention, of the test kit according to the invention and of the medicament.
  • GABA ⁇ -aminobutyrate
  • GABA is the predominant inhibitory neurotransmitter and is widely distributed in the mammalian nervous system. GABA is displaced at the synaptic cleft by specific high-affinity transporters, of which at least four (GAT1-GAT4) have been cloned. In situ hybridization has shown that GAT 1 and GAT4 expression are brain specific.
  • the GATl GABA transporter (human 559 sequence) is approximately 2298 nucleotides long and contains a predictive a methionine-initiating coding sequence of about 1800 nucleotides, including stop codon.
  • the coding sequence located approximately between nucleic acids 235 and 2034, encodes a GAT 1 GABA transporter protein.
  • GABA activity at the GABA A receptor results in hyperpolarization of the synapses due to inflowing chloride ions.
  • the GAT 1 GABA transporter pumps GABA into the cell from the outside.
  • the hyperpolarization resulting from the blockage of the GABA transporter leads to an inhibitory effect on smooth muscle cell contraction.
  • modulators of the activity of the GAT 1 GABA transporter would be of great interest for the treatment of epilepsy and various cognitive disorders.
  • Radioactive measurements require specially trained personnel and necessary safety equipment. Both methods can only be performed “offline” and require “mediators” in the form of color reagents or radioactively labeled substrates. What is determined is not the immediate enzyme activity, but the change in a substrate concentration after completion of the transport. These Substrates capture transport activity very slowly over the course of minutes.
  • electrophysiological methods for example the so-called patch-clamp technique or two-electrode voltage-clamp technique, in which, for example, cells are accessible in isolation from an electrophysiological examination.
  • patch-clamp technique or two-electrode voltage-clamp technique
  • native cells are exposed to different conditions and certain electrical activities mediated across the cell membrane by proteins, protein complexes or the like contained therein are measured.
  • the present invention relates to an active ingredient or active ingredient complex, a method for producing a drug, a test kit for carrying out the erfmdungsgespecializeden method, a screening method, as well as uses of the method, the test kit and the drug.
  • Advantageous developments are the subject of the respective dependent claims.
  • GATl sodium and chloride ions are shifted across the membrane together with GABA ( ⁇ -ammobutyrate).
  • GABA ⁇ -ammobutyrate
  • the invention is based on the idea of measuring this GABA-dependent charge shift directly as binding of enzyme preparations on a suitable surface, which is integrated in a flow-through system or in which a substrate jump can be carried out, as the current flow and the influence of different active substances on the measured current flow to investigate.
  • the invention thus relates to a method for identifying an active substance complex which modifies an enzymatic property and / or the transport behavior of an active site complex which contains a GAT1 protein or a part thereof.
  • the erfmdungsgelaute method comprises the following steps: (a) providing a plurality of primary carriers which comprise the active site complex containing the GAT1 protein, in particular in a plurality in the region of a membrane of the respective primary carrier,
  • step (h) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a third or activating measurement medium and detecting an electrical action according to process step (e), wherein the third or activating measurement medium corresponds to the second or non-activating medium but additionally contains a substrate of the GAT1 protein , in particular instead of a non-substrate present in the second or non-activating medium.
  • the erfmdungsgesorgeen steps (f), (g), (h) are - optionally carried out with repetitions - preferably in the predetermined order.
  • the term "enzymatic property" of the GAT1 proteme also always means the transport behavior, e.g. The mediated by these proteins substrate and / or ion transport and thus always refers to the initially discussed influence of the protein on the bioavailability of potential drugs. Wherever there is talk of the modification of the enzymatic properties of the protein, according to the invention investigations are also included which show whether a certain substance is transported by the GAT1 proteme.
  • the potential active substance can be present in all media.
  • the potential active substance In order to check whether a potential active substance is being transported, the potential active substance should be be present medium, but not in the accumulation buffer or in the non-activating medium.
  • the first medium or the attachment buffer Preferably, the first medium or the attachment buffer
  • - Cl is not or in low concentrations, in particular in lower concentrations than in the second or non-activating medium and as in the third or activating medium
  • pH 6-8 more preferably about 7.
  • the second medium or non-activating medium preferably contains:
  • pH 6-8 more preferably about 7
  • the third medium or activating medium preferably contains:
  • a substrate of the GATl protein more preferably GABA in a concentration of between 1 ⁇ mol / l and 10 mmol / l.
  • the quiescence / addition solution may be chloride free and contain gluconate.
  • the doses contain chloride.
  • any other anion that is not transported by GATl should also be able to be included in the deposition medium.
  • the active site complex or part thereof used is a monomer or an oligomer of a GAT1 protein.
  • an active ingredient or active substance complex identified by the process according to the invention, which modifies an enzymatic property of an active site complex which contains a GAT1 protein or a part thereof.
  • an active site complex or a part thereof based on a GAT1 protein derived from a tissue of a mammal e.g. from the small intestine, kidney or liver, or derived therefrom.
  • the GAT1 protein originates from mammalian cells and is present in cloned form.
  • the active site complex containing the GATl protein is derived from or derived from the organisms rat, pig, monkey, mouse, rabbit or human.
  • aqueous solutions and, in particular, aqueous electrolyte solutions are used as the measurement solution or measuring medium which, as an addition buffer, does not activate and activating solutions or media.
  • All measuring solutions used contain a buffer known to those skilled in the art, preferably selected from: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES and the like. a., as they are e.g. in "Buffers, Calbiochem", but also publications and textbooks of chemistry, biology or biotechnology can be found. According to the invention, these agents should buffer at pH 6 to 8, preferably at about pH 7. The choice of the appropriate pH range or of the buffer can depend on the substrate (active substance complex) and can be determined by a person skilled in the art by routine experiments.
  • an attachment buffer is also used, composed of K-gluconate, MgCl 2 , Hepes, pH 7 / NMG, and DTT.
  • an attachment buffer composed of K-gluconate, MgCl 2 , Hepes, pH 7 / NMG, and DTT.
  • any other cation species of the 1st or 2nd main group of the PSE or choline "1" can also be used, the cation concentration being approximately as high as in the activating or non-activating solution.
  • the active substance complex or a part thereof can be transported directly to the site complex by injection or admixing into the measuring medium.
  • Such a process is simple if the respective measuring medium is exchanged, for example in a continuous manner.
  • the active substance is released only by a chemical or physical reaction or reaction in the measuring medium. This can be done for example by irradiation.
  • the qualitative and / or quantitative influence of the potential drug or drug complex is determined according to the invention by detecting an electrical action mediated by the active site complex or a part thereof and in particular by the GAT1 protein.
  • the electric action used is an electric current generated by the site complex or a part thereof or an electric potential generated therefrom, which is generated by charge or mass transport or displacement, conformational changes, ligand binding, annealing or release, or a Combination of it.
  • This electrical action is determined with and without potential drug, and by comparing both series of measurements, it is examined whether the potential drug has an influence on the enzymatic properties of the GAT1 protein.
  • the primary carriers are brought into contact with the active site complexes on a secondary carrier, namely the biosensor electrode and, above all, with their isolation region, and are deposited there.
  • a secondary carrier namely the biosensor electrode and, above all, with their isolation region, and are deposited there.
  • a biosensor electrode as a secondary substrate, in which an electrically conductive and fixed-body electrode region is provided with at least one electrode which is electrically and mechanically isolated from the measuring medium and from the primary carriers by providing an insulating region in the form of a solid-body-supported membrane , which is constructed in a layered manner from a lower layer of an organic thio compound as the lower and the electrode respectively facing layer and an upper layer of an amphiphilic organic compound.
  • a biosensor electrode is used as a secondary carrier, wherein an electrode in the electrode region of gold or a gold alloy, with a monolayer of a long-chain alkanethiol as a lower layer and a monolayer of a lipid as a top layer on it.
  • a biosensor electrode is used as a secondary carrier, in which the region of the isolation region covering one electrode of the biosensor electrode as a secondary carrier is or is formed as a membrane structure in the manner of a solid-body-supported double-layer membrane or bilayer membrane.
  • each eukariontician cell a prokariontician cell, in particular an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or constituents thereof, in particular membrane fragments, or associations thereof in native form and / or in modified form, in particular purified and / or modified form.
  • a vesicle, a liposome or a micellar structure can also be used as the primary carrier.
  • the membrane fragments can also attach planar, i. as a non-spherical structure.
  • the erfmdungsgedorfe method is particularly advantageous if the sensor assembly of biosensor electrode as a secondary carrier and P ⁇ mar- trolls attached thereto in a measuring chamber, measuring range or measuring vessel flows around the medium or is flown.
  • a change in concentration with respect to the active substance complex or a part thereof can be easily achieved by changing the measuring medium.
  • such measuring in the context of a flow system can reliably set the experimental conditions with high time resolution. Even with an automated pipettor, the erfmdungsgedorfe method can be advantageously carried out.
  • the erfmdungsgerate method designed when successively a plurality of tests is performed, in particular by successively replacing the measuring medium, possibly with intervening washing or coils of the measuring space. It is important in the present inventive method to compare the action of the active site complex in the present active substance complex with a situation in which the potential active substance complex is not present. This can be done, for example, by changing between activating medium to be activated in the presence or absence of the potential active substance complex and comparing the measured values obtained.
  • Potential active substances to be tested are particularly preferably monoclonal antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies and peptides. However, other substances that are suspected of having an effect can also be added. These substances are preferably administered in dissolved form.
  • Particularly preferred substances that can be tested as test substances in the test system according to the invention are low molecular weight compounds. Such compounds often have little or no side effects when used as an active principle in a pharmaceutical composition. Another advantage of such substances is the possibility of oral administration.
  • cyclic pentapeptides as described by Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7641-7472.
  • small peptides, amino acids and amino acid analogues, steroids, nucleotides and other organic chemical substances having a molecular weight of ⁇ 5000, preferably ⁇ 3000 and particularly preferably ⁇ 2000, are attributed to the low molecular weight substances. It can be added to the active substance complex both in the addition buffer, in the non-activating medium and in the activating medium or released there.
  • a washing step is carried out between steps (f) and (h) by introducing the secondary carrier with the primary carriers into a fourth or washing medium, which is preferably identical to the non-activating medium.
  • step (f) is carried out repeatedly before step (h) in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention.
  • step (f) is initiated before the beginning of the actual measurement series, i. before the steps (g) and (h) are carried out for the first time for at least 5 minutes (min), preferably for at least 10 min, more preferably for at least 15 min, even more preferably for at least 20 min and especially preferably for at least 30 min is performed.
  • steps (g) and (h) are carried out for at least 0.5 seconds (sec), but not more than 5 seconds and preferably for about 1-2 seconds.
  • step (f) is carried out for at least 1 second to at most 120 seconds, preferably for at least 30 seconds to 90 seconds, and particularly preferably for 50 seconds to 70 seconds.
  • the addition medium has potassium ions in concentrations in the range of about 10 mmol / l to about 200 mmol / l, preferably in the range of about 140 mmol / l.
  • the attachment medium has chloride ions in concentrations of about 0 mmol / 1 to 100 mmol / l, preferably in the range of about 4 mmol / l, in any case significantly less than the non-activating medium and the activating medium.
  • the other media ie the non-activating medium and the activating medium, have sodium ions in concentrations ranging from about 10 mmol / l to about 200 mmol / l, preferably in the range of about 140 mmol / l.
  • These media, ie the non-activating medium and the activating medium additionally have chloride ions in concentrations in the range of about 10 mmol / l to about 200 mmol / l, preferably in the range of about 140 mmol / l.
  • the quiescent / addition solution may be chloride free and contain gluconate.
  • the measuring solutions contain chloride. Instead of gluconate, any other anion that is not transported by GATl should also be able to be included in the deposition medium.
  • the activating medium contains a substrate of the GATl protein, preferably GABA.
  • Other possible substrates are other neurotransmitters.
  • the concentration may vary depending on the application.
  • GABA may be used in the range of about one or a few hundred ⁇ mol / l to a few tens of mmol / l, eg in the range of about 50 ⁇ mol / 1 to about 5 mmol / l, preferably in the range of about 100 ⁇ mol / l to about 1.5 mmol / l.
  • a concentration in the range above may also be expedient, for example in the range from about 1 mmol / l to about 100 mmol / l.
  • 10 mmol / l VaIm, 140 mmol / l NaCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l Hepes pH 7 / NMG and 200 ⁇ M DTT are alternatively used as non-activating medium.
  • 10 mmol / 1 GABA, 140 mmol / l NaCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l Hepes pH 7 / NMG and 200 ⁇ mol / 1 DTT are alternatively used as activating medium in a particularly preferred embodiment of the inventive method ,
  • the present invention provides a drug or drug complex which modifies an enzymatic property of an active site complex containing a GAT1 protein, or a portion thereof, or a plurality of properties.
  • the enzymatic property used is:
  • the present invention provides a method for producing a medicament comprising the steps of: Identifying an active substance and / or an active substance complex which suitably modifies an enzymatic property of an active substance complex which contains a GAT1 protein, of a part thereof or a plurality of properties,
  • test kit for carrying out the erfmdungsgeschreiben method for identifying a drug complex. This test kit points to:
  • At least one primary carrier for example with the GAT1 protein
  • a screening method for identifying namely for identifying: an unknown active substance, active substance complex, a part and / or derivative thereof,
  • the active substance, the active ingredient complex, a part or derivative thereof is an enzymatic property of a Wirkortkomplexes which contains a GATl proteme, or a part thereof modified.
  • the method according to the invention is used for identifying an active substance complex for finding inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of an active site complex which contains a GAT1 protein, for example a human GAT1 proteme.
  • test kit according to the invention is used according to the invention for finding inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators a GATl protein-containing active site complex, such as a human GATl proteme.
  • the medicament according to the invention is used for the inhibition, partial or temporary inhibition, activation or other modulation of a GATl protease-containing active substance complex or a part thereof, for example a human GATl proteme.
  • a z As wassriges measuring medium provided in which the primary carriers and the secondary carriers are arranged.
  • the electrode region is preferably largely electrically insulated from the measuring medium, the primary carriers and from the biological units.
  • the electrode area has e.g. at least one electrode.
  • this can itself be designed as a mechanically stable material region, in particular as a plate, as a wire and / or the like.
  • the electrode is essentially designed as a material layer deposited on the surface of the carrier. It may be a vapor-deposited or sputtered material layer.
  • the material layer for forming the electrode preferably has a layer thickness of about 10 to 200 nm.
  • the GAT1 proteme can in each case be used in substantially native form and / or in a modified, in particular purified, microbiologically and / or molecularly modified form. On the one hand, this allows specific native properties to be tested and pharmacologically examined. On the other hand, molecular-biological or genetically engineered changes are also suitable certain aspects, for example, the transport or the pharmacological mode of action of an active substance.
  • magnetic carriers of a respectively substantially uniform type of primary carrier are provided. This is important with regard to the most unambiguous statement and analysis of a drug test and refers to the geometric, physical, chemical, biological and molecular-biological properties of the primary carriers.
  • one of the objects of the invention is to make the effect of substances on the function of GAT1 proteins amenable to investigation.
  • Substances that modulate the action of this transport protein are considered to be potential drugs, e.g. for the treatment of epilepsy and various cognitive disorders of commercial interest.
  • substrates of the protein transported by this were interesting new molecules.
  • the inventive method offers the following advantages:
  • the measurement of the enzyme activity according to the method proposed according to the invention requires no mediators or labeled substrates. A single measurement takes only a few seconds. The measurement is sensitive to all substrates. If a substance does not irreversibly inhibit the reaction, several measurements can be taken with an enzyme-loaded sensor. Substrates need not be chemically modified because the current response or potential response of the protein is induced by a rapid solution change.
  • the gold surface was made by inserting in a 1 mmol / l / l
  • the membrane fragments were prepared according to the following protocol: per liter cell pellet ImI sucrose buffer (0.25 mol / l sucrose, 5 mmol / l Tris, pH 7.5, about 2 mmol / l DTT, PMSF *, Complete **) ; * 50 ⁇ l PMSF as a saturated ethanolic solution to 100 ml buffer; ** Complete / Fa. Roche, one tablet per 50ml buffer.
  • the capacity of the protein-loaded membranes was about 300-1000 nF cm “2 , the conductivity G ls at about 10-100 nS cm "
  • the flow cell with integrated protembeladenem sensor chip was first with accumulation buffer (see above, 200 .mu.mol / 1 DTT instead of 2 mmol / 1) impressspult. This was followed by the non-activating solution (10 mmol / 1 valine, 140 mmol / l NaCl, 2 mmol / l MgCl 2 , 30 mmol / l Hepes pH 7 / NMG, 200 ⁇ mol / 1 DTT) and by electromechanical 3/2 Directional valve was then switched to activating solution (10 mmol / 1 GABA, 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes pH 7 / NMG, 200 .mu.mol / 1 DTT). The cotransport of sodium, chloride and GABA leads to a positive signal, as positive charge carriers are shifted to the membrane.
  • Example 5 Activity measurement without the cosubstrate sodium
  • Fig. 1 shows the current response of the loaded with GATl
  • FIG. 2 shows the current response of the control membrane-loaded biosensor to a GABA concentration jump.
  • FIG. 3 Current response of the GATl-loaded biosensor to a GABA concentration jump in different concentrations.
  • the ordinate of the figures thus denotes the measured electric current I (t), as a function of the time t, which is measured via the biosensor electrode.
  • Shown in FIG. 1 are three measuring tracks A, B and C, which correspond to different measuring conditions with respect to the substrate concentration at GABA.
  • GABA transport by means of the GATl protein, sodium and chloride ions are transferred via the primer carriers, e.g. via membrane fragments or vesicles, towards the biosensor membrane and the electrode.
  • the primer carriers e.g. via membrane fragments or vesicles
  • Lane B in Fig. 1 shows a measurement using 140 mmol / l KCl instead of NaCl. Without the cosubstrate of the sodium ions, which is no longer available for GABA transport when NaCl is replaced by KCl, sodium chloride GABA transport can no longer take place.
  • Lane C in FIG. 1 shows a measurement in which, in the presence of 140 mmol / l NaCl again by means of the GATl protein, sodium and chloride ions are moved toward the biosensor membrane and the electrode via the primary carriers. This can be seen analogously to track A in FIG. 1 on the measured positive current signal.
  • Fig. 2 shows the according to another embodiment of the inventive method with a biosensor electrode measured electric current I as a function of time t, using control membranes in which no GATl is present.
  • a biosensor electrode measured electric current I as a function of time t, using control membranes in which no GATl is present.
  • FIG. 3 shows four measuring tracks which correspond to different measuring conditions with respect to the substrate concentration at GABA.
  • the GAT1 protein units are normally activated, at 5 mmol / l and even more strongly at 2.5 mmol / l already a clearly visible decrease of the maximum of the measured positive electric current I (t) can be detected.
  • the signal is only slightly above the background noise.
  • Figure 3 thus shows the relevance of the presence of GABA for the transport activity of the GAT1 entities.
  • Fundamental advantages of the present invention are the high mechanical stability of the proposed sensor arrangement and, associated with it, the great operational readiness, the ease of handling and the low susceptibility to interference.
  • the use of the sensor arrangement results in a long service life, high reliability, low susceptibility to interference and, in particular, a significantly increased test throughput compared with conventional methods, whereby corresponding test methods can be elaborated and carried out inexpensively.
  • the signal quality is better, for a better signal-to-noise ratio.

Abstract

Vorgeschlagen wird ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffes, welcher eine enzymatische Eigenschaft des GAT1-Proteins modifiziert. Es werden Primärträger bereitgestellt, welche das GAT1-Protein im Bereich ihrer Membranen enthalten. Die Primärträger werden im Oberflächenbereich einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode angelagert. Es wird ein potentieller Wirkstoff bereitgestellt. Der potentielle Wirkstoff wird mit dem GAT1-Protein zur Wechselwirkung gebracht. Bestimmt wird der qualitative und/oder quantitative Einfluss des potentiellen Wirkstoffes durch Detektieren einer elektrischen Aktion des GAT1- Proteins oder deren Änderung über die Biosensorelektrode als Sekundärträger, z.B. mittels einer elektrischen Strommessung oder Spannungsmessung.

Description

GATl -As say
Die Erfindung betrifft einen GATl-Assay und insbesondere ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Transportaktivitat von GAT-I beeinflussen oder von GATl werden .
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfindungsgemaßen Verfahren identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, einen Testkit zum Durchfuhren des erfindungsgemaßen Verfahrens, ein Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfindungsgemaßen Verfahrens, des erfindungsgemaßen Testkits sowie des Arzneimittels.
Die Fortschritte in der pharmazeutischen Wirkstoffentwick- lung bewirken ein rasches Ansteigen der Anzahl von potentiell zur Verfugung stehenden therapeutischen Mitteln. Es ist jedoch häufig ein großes Problem, die entsprechenden Mittel so zu formulieren, dass sie bioverfugbar sind, d.h. vom Korper hinreichend aufgenommen werden, um eine optimale Wirksamkeit bzw. Verträglichkeit zu sichern.
Natürliche Transportproteine spielen bei der Aufnahme un- terschiedlicher Moleküle eine wichtige Rolle.
GABA (γ-Aminobutyrat ) ist der vorherrschende inhibitorische Neurotransmitter und im Nervensystem von Saugetieren weit verbreitet. GABA wird am synaptischen Spalt durch spezifi- sehe hoch affine Transporter verdrangt, von denen mindestens vier (GAT1-GAT4) kloniert wurden. In situ Hybridisierung hat gezeigt, dass GAT 1 und GAT4 Expression gehirnspezifisch ist .
Der GATl GABA Transporter (humane 559 Sequenz), ist ungefähr 2298 Nukleotide lang und beinhaltet eine vorausberech- nete Methionin initiierende codierende Sequenz von etwa 1800 Nukleotiden, einschließlich Stoppcodon. Die codierende Sequenz, die etwa zwischen Nukleinsäuren 235 und 2034 lokalisiert ist, codiert für ein GAT 1 GABA Transporter Prote- in .
GABA Aktivität am GABA A Rezeptor resultiert in Hyperpola- risation der Synapsen durch einströmende Chloridionen. Der GAT 1 GABA Transporter pumpt GABA von außen in die Zelle. Die Hyperpolarisation, die durch die Blockierung des GABA Transporters entsteht, führt zu einem inhibitorischen Effekt auf die Zellkontraktion des glatten Muskels.
Für die Funktion von GATl ist also ein Chloridgradient essentiell .
Im Hinblick auf die funktionale Rolle und das Expressionsmuster wären Modulatoren der Aktivität des GAT 1 GABA Transporters von großem Interesse zur Behandlung von Epilepsie und verschiedenen kognitiven Störungen.
Entsprechend sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.
Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. am GATl- Protein, an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.
So sind Bindungs- bzw. Aufnahmestudien von radioaktiv markierten Substraten an GATl-überexprimierten Zellen bereits im Stand der Technik beschrieben. Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich und die damit erzielten Ergebnisse haben nur eine beschrankte Aussagekraft.
Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise einer Betrachtung zugänglich gemacht .
Es sind zum Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbeiten, und sich ändernde Transport- und/oder Bindungsspezifitaten ausnutzen und darstellen. Die Untersuchung der Wirkung von Substanzen bei radioaktiven Bindungs- und Aufnahmeassays lasst aber in der Regel keine Unterscheidung zu, ob ein Wirkstoff nur bindet oder auch transportiert wird (dazu mussten alle Wirkstoffe radioaktiv markiert sein) .
Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfalligkeit zukommen. Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.
Radioaktive Messungen bedürfen speziell ausgebildeten Per- sonals sowie notwendiger Sicherheitseinrichtungen. Beide Methoden können nur "offline" durchgeführt werden und erfordern "Vermittler" in Form von Farbereagenzien oder radioaktiv markierten Substraten. Bestimmt wird nicht die unmittelbare Enzymaktivitat, sondern die Änderung einer Substratkonzentration nach Abschluss des Transportes. Diese Substrate erfassen die Transportaktivitat sehr langsam im Laufe von Minuten.
Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die so genannte Patch-Clamp-Technik oder Zwei- Elektroden-Voltage-Clamp-Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung zuganglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltene Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.
Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektrophysiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes, ihrer Störanfälligkeit und ihres sehr geringen Durchsatzes für einen schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile aufweisen.
Darüber hinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv, da beispielsweise erfahrenes Personal für die Durchfuhrung benotigt wird. Ferner ist für die Patch-Clamp-Methode und die Zwei-Elektroden-Voltage-Clamp-Methode eine Zellkultureinheit bzw. die Haltung von Xenopus laevis Fröschen erforderlich .
Ein besonders gunstiges Verfahren zum Messen von elektrochemischen Vorgangen an beispielsweise Membranfragmenten wird in der WO 02/074983 beschrieben, auf die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung Bezug genommen wird. Eine Verwendung des dort offenbarten Verfahrens zur Testung an GATl-Proteinen wird nicht offenbart. Der Erfindung lxegt daher die Aufgabe zugrunde, einen GATl- Protem-Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massenbetrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.
Gelost werden diese und weitere Aufgaben, die sich aus dem eingangs diskutieren Stand der Technik ergeben, durch ein
Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes mit allen Merkmalen des Anspruchs 1.
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, ein Testkit zur Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfahrens, ein Screeningverfahren, sowie Verwendungen des Verfahrens, des Testkits sowie des Arzneimittels. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der jeweiligen abhangigen Unteranspruche .
Im Transportzyklus von GATl werden Natrium- und Chloπdio- nen zusammen mit GABA (γ-Ammobutyrat ) über die Membran verschoben. Der Erfindung liegt die Idee zugrunde, diese GABA-abhangige Ladungsverschiebung direkt durch Anbindung von Enzympraparationen auf einer geeigneten Oberflache, die in ein Durchflusssystem integriert ist oder bei der ein Substratsprung durchgeführt werden kann, als Stromfluss zu messen und den Einfluss verschiedener Wirkstoffe auf die Messgroße Stromfluss zu untersuchen.
Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft und/oder das Transportverhalten eines Wirkort- komplexes, welcher ein GATl-Protein oder ein Teil davon enthalt, modifiziert. Das erfmdungsgemaße Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den Wirkortkomplex enthaltend das GATl-Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflächenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger bevorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potentiellen Wirkstoff- komplexes,
(d) In-Kontakt-Bringen und In-Wechselwirkung-Bringen des potentiellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkort komplex der Primärträger oder Teilen davon, und
(e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potentiellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer e- lektrischen Aktion oder des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundärträger, dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in einen Anlagerungspuffer und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß Verfahrensschritt (e) (g) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern m ein zweites mcht-aktivierendes Medium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß Verfahrensschritt (e), wobei im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium ein Nicht- Substrat von GAT-I vorgesehen ist,
(h) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Messmedium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des GATl-Proteins enthalt, insbesondere anstelle eines im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium vorhandenen Nicht-Substrats.
Die erfmdungsgemaßen Schritte (f), (g), (h) werden - gegebenenfalls mit Wiederholungen - bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck "enzymatische Eigenschaft" des GATl-Protems gleichzeitig auch immer das Transportverhalten, z.B. den durch diese Proteine vermittelten Substrat- und/oder Ionentransport und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfugbarkeit potentieller Wirkstoffe. Wo immer von der Modifizierung der enzymati- schen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, sind erfin- dungsgemaß auch Untersuchungen mit umfasst, die zeigen, ob ein bestimmter Stoff vom GATl-Protem transportiert wird.
Soll geprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das GATl-Protem aktiviert oder inhibiert, kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.
Soll geprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff im aktivie- renden Medium vorhanden sein, nicht jedoch im Anlagerungspuffer bzw. im nicht-aktivierenden Medium.
Bevorzugt enthalten das erste Medium oder der Anlagerungspuffer
- K+,
- Cl nicht oder in niedrigen Konzentrationen, insbesondere in niedrigeren Konzentrationen als im zweiten oder nicht- aktivierenden Medium und als im dritten oder aktivierenden Medium
- gegebenenfalls Mg++ und
- pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7.
Das zweite Medium oder nicht-aktivierende Medium enthalten bevorzugt :
- Na+,
- Cl", - gegebenenfalls Mg++,
- pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7,
Das dritte Medium oder aktivierende Medium enthalten bevorzugt :
- Na+,
- Cl",
- gegebenenfalls Mg++,
- pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, - enthält, sowie
- ein Substrat des GATl-Proteins , weiter bevorzugt GABA in einer Konzentration zwischen 1 μmol/1 und 10 mmol/1.
Bevorzugt wird als Messmedium und insbesondere als zweites oder nicht-aktivierendes Medium und/oder besonders bevorzugt als drittes oder aktivierendes Medium Medien mit GABA verwendet, xnsbesondere mit einer Konzentration von etwa 1 μmol/1 bis 10 mmol/1.
Für die Funktion von GATl ist also ein Chloridgradient essentiell. Daher kann die Ruhe-/Anlagerungslosung chloridfrei sein und Gluconat enthalten. Die Messlosungen enthalten Chlorid. Statt Gluconat sollte auch jedes andere Anion, das von GATl nicht transportiert wird, im Anlagerungsmedium enthalten sein können.
Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein Oligomer eines GATl-Proteins verwendet.
Weiter bevorzugt ist ein nach dem erfindungsgemaßen Verfah- ren identifizierter Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, der ein GATl-Protein enthalt, oder eines Teils davon modifiziert .
Ferner wird ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet, welcher auf einem GATl-Protein basiert, das aus einem Gewebe eines Saugetiers stammt, z.B. aus dem Dünndarm, der Niere oder der Leber, oder hieraus abgeleitet ist.
Insbesondere stammt das GATl-Protein aus Saugetierzellen und liegt kloniert vor.
Vorzugsweise stammt der Wirkortkomplex, der das GATl- Protein enthalt, aus den Organismen Ratte, Schwein, Meer- schwem, Maus, Kaninchen oder Mensch oder ist aus diesen genetisch abgeleitet.
Erfindungsgemaß werden wassrige Messlosungen und insbesondere wassrige Elektrolytlosungen als Messlosung oder Mess- medium verwendet, die als Anlagerungspuffer, nicht aktivie- rende sowie aktivierende Lösungen oder Medien bezeichnet werden .
Alle verwendeten Messlösungen enthalten ein dem Fachmann bekannten Puffer bevorzugt ausgewählt aus: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u. a., wie sie z.B. in "Buffers, Calbio- chem" veröffentlicht sind, aber auch Veröffentlichungen und Lehrbüchern der Chemie, Biologie oder Biotechnologie entnommen werden können. Erfindungsgemäß sollen diese Mittel bei pH 6 - 8, bevorzugt bei etwa pH 7 puffern. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs bzw. des Puffers kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex) abhängen und vom Fachmann durch Routineexperimente ermittelt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird auch ein Anlagerungspuffer verwendet, zusammengesetzt aus K- gluconat, MgCl2, Hepes, pH 7/NMG, und DTT. Allerdings ist auch jede weitere Kationenspezies der 1. oder 2. Hauptgruppe des PSE oder Cholin"1" verwendbar, wobei die Kationenkon- zentration in etwa so hoch ist wie in der aktivierenden oder nicht-aktivierenden Lösung.
Erfindungsgemäß können die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) , gegebenenfalls auch (f) bis (h) mittels
- Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes , eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,
Austauschen oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder
chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon
durchgeführt werden. Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein zum Wirkortkomplex transportiert werden kann. Einfach gestaltet sich ein derartiger Vorgang, wenn das jeweilige Messmedium ausgetauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Weiter besteht die Möglichkeit, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann beispielsweise durch Bestrahlung erfolgen.
Der qualitative und/oder quantitative Einfluss des potentiellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das GATl-Protein vermittelt wird .
Als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirk- ortkomplex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial, welches jeweils erzeugt wird durch Ladungs- oder Stofftransport oder -Verschiebung, Konformationsänderungen, Ligandenbindung, -anlagerung oder -freigäbe, oder einer Kombination davon.
Diese elektrische Aktion wird mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Messreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des GATl- Proteins .
Wie in der WO02/074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirkortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode und vor allem mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort angelagert. Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundar- trager bestehen vielfaltige Möglichkeiten.
Besonders bevorzugt wird eine Biosensorelektrode als Sekun- dartrager verwendet, bei welcher ein elektrisch leitfahiger und festkorperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen ist, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primartragern elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbe- reichs in Form einer festkorperunterstutzten Membran, welche schichtartig aufgebaut ist aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfmdungsgemaßen Verfahrens wird eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet, bei welcher eine Elektrode im Elektrodenbereich aus Gold oder einer Goldlegierung ist, mit einer Mono- schicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundartrager abdeckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkorperunterstutzten Doppel- schichtmembran oder Bilayermembran ausgebildet wird oder ist.
Im Hinblick auf die Primartrager, welche den Wirkortkomplex und die GATl-Proteme im Bereich ihrer Membran enthalten, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen wird. Für das erfmdungsgemaße Verfahren kann als Primartrager jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet werden.
Als Primartrager können auch jeweils ein Vesikel, ein Lipo- som oder eine mizellare Struktur verwendet werden. Die Membranfragmente können auch planar anlagern, d.h. als nicht sphärische Struktur.
Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfmdungsgemaße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensor- elektrode als Sekundartrager und daran angelagerten Pπmar- tragern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefaß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird.
So lasst sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems zuverlässig mit hoher Zeitauflosung die erfmdungsge- maßen Versuchsbedingungen einstellen. Auch mit einer automatisierten Pipettlervorrichtung kann das erfmdungsgemaße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.
Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich gestaltet sich das erfmdungsgemaße Verfahren dann, wenn aufeinander folgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinander folgendes Austauschen des Messmediums, ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spulen des Messraums. Wichtig ist bei dem vorliegenden erfindungsgemaßen Verfahren das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potentielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen mcht-aktivierendem zu aktivierendem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.
Potentielle zu testende Wirkstoffe sind insbesondere bevorzugt monoklonale Antikörper, Antikorperfragmente, polyklo- nale Antikörper und Peptide. Es können jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, dass sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht .
Besonders bevorzugte Substanzen, die als Testsubstanzen in dem erfindungsgemaßen Testsystem untersucht werden können, sind niedermolekulare Verbindungen. Solche Verbindungen haben oft keine oder nur geringe Nebenwirkungen, wenn sie als aktives Prinzip in einer pharmazeutischen Zusammensetzung eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil solcher Substanzen ist die Möglichkeit der oralen Verabreichung.
Beispiele hierfür sind zyklische Pentapeptide, wie sie von Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 7641-7472, beschrieben wurden. Erfindungsgemaß werden den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosaure- analoga, Steroide, Nukleotide und weitere organischchemische Stoffe mit einem Molekulargewicht von ≤ 5000, bevorzugt ≤ 3000 und besonders bevorzugt ≤ 2000 zugerechnet. Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Anlagerungspuffer, im nicht-aktivierenden Medium als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt werden.
Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primartrager mit dem Wirkstoffkomplex denkbar.
Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein viertes oder Waschmedium, welches bevorzugt mit dem nicht- aktivierenden Medium identisch ist.
Ferner ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungs- gemaßen Verfahrens der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird .
Es ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen Messreihe, d.h. bevor zum ersten Mal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens 5 Minuten (min) , bevorzugt für mindestens 10 min, besonders bevorzugt für mindestens 15 min, noch mehr bevorzugt für mindestens 20 min und insbesondere bevorzugt für mindestens 30 min durchgeführt wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfindungsgemaß für mindestens 0,5 Sekunden (sec), höchstens jedoch 5 sec und bevorzugt für etwa 1-2 sec durchgeführt. Nach der erstmaligen Durchfuhrung der Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 sec bis höchstens 120 sec durchgeführt, bevorzugt für mindestens 30 sec bis 90 sec, und besonders bevorzugt für 50 sec bis 70 sec.
Das Anlagerungsmedium weist Kaliumionen in Konzentrationen im Bereich von etwa 10 mmol/1 bis etwa 200 mmol/1 auf, bevorzugt im Bereich von etwa 140 mmol/1. Das Anlagerungs- medium weist Chloridionen in Konzentrationen von etwa 0 mmol/1 bis 100 mmol/1 auf, bevorzugt im Bereich von etwa 4 mmol/1, auf jeden Fall deutlich weniger als das nicht aktivierende Medium und das aktivierende Medium.
Die anderen Medien, also das nicht aktivierende Medium und das aktivierende Medium weisen Natriumionen in Konzentrationen im Bereich von etwa 10 mmol/1 bis etwa 200 mmol/1 auf, bevorzugt im Bereich von etwa 140 mmol/1. Diese Medien, also das nicht aktivierende Medium und das aktivierende Medium weisen daneben Chloridionen in Konzentrationen im Bereich von etwa 10 mmol/1 bis etwa 200 mmol/1 auf, bevorzugt im Bereich von etwa 140 mmol/1.
Für die Funktion von GATl ist also ein Chloridgradient essentiell. Daher kann die Ruhe-/Anlagerungslösung chloridfrei sein und Gluconat enthalten. Die Messlösungen enthalten Chlorid. Statt Gluconat sollte auch jedes andere Anion, das von GATl nicht transportiert wird, im Anlagerungsmedium enthalten sein können.
Des Weiteren enthält das aktivierende Medium ein Substrat des GATl-Proteins , bevorzugt GABA. Weitere mögliche Substrate sind andere Neurotransmitter.
Die Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompetitionsuntersuchungen kann GABA im Bereich von etwa einem oder einigen hundert μmol/1 bis zu einigen zehn mmol/1 eingesetzt werden, z.B. im Bereich von etwa 50 μmol/1 bis etwa 5 mmol/1, bevorzugt im Bereich von etwa 100 μmol/1 bis etwa 1,5 mmol/1. Bei Wirkstofftestungen auf Aktivierung und/oder Inhibierung des GATl-Proteins kann auch eine Konzentration im Bereich darüber sinnvoll sein, z.B. im Bereich von etwa 1 mmol/1 bis etwa 100 mmol/1. Erfindungsgemaß werden alternativ als nicht-aktivierendes Medium 10 mmol/1 VaIm, 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes pH 7/NMG und 200 μM DTT verwendet.
Erfindungsgemaß werden ferner alternativ bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens als aktivierendes Medium 10 mmol/1 GABA, 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes pH 7/NMG und 200 μmol/1 DTT verwendet.
Gemäß eines weiteren Aspekts schafft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl-Protein enthalt, oder ein Teil davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften modifiziert.
Als enzymatische Eigenschaft wird dabei verwendet:
- die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkom- plexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder ei- nes Teils davon,
- die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- eine Konformationsanderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten: - Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes , welcher ein GATl-Protein enthalt, o- der eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaf- ten geeignet modifiziert,
- Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes , eines Teils und/oder eines Derivats davon,
- Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats,
- Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoff- komplexes, Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch vertraglichen Tragersubstanz.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Testkit zur Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes . Dieses Testkit weist auf:
- mindestens einen Primartrager beispielsweise mit dem GATl-Protein,
- einen Messbereich,
- gegebenenfalls der erfmdungsgemaße Anlagerungspuffer, das nicht-aktivierende Medium oder das aktivierende Medi- um und
- weiterhin gegebenenfalls mindestens einen potentiellen Wirkstoffkomplex .
Erfindungsgemaß wird auch ein Screenmgverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren: - eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , eines Teils und/oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats davon,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats davon.
Diese bezuglich des Screemngverfahrens genannten Großen oder Eigenschaften des verwendeten erfindungsgemaßen Verfahrens sind beliebig kombinierbar.
Dabei ist der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, ein Teil oder Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welche ein GATl-Protem enthalt, oder einen Teil davon modifiziert.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemaße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl-Protein enthalt, beispielsweise ein humanes GATl-Protem.
Des Weiteren wird das erfindungsgemaße Testkit erfmdungs- gemaß verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren eines GATl-Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes, beispielsweise ein humanes GATl-Protem.
Des Weiteren wird das Arzneimittel erfmdungsgemaß verwen- det zur Inhibition, partiellen oder temporaren Inhibition, Aktivierung oder sonstigen Modulation eines GATl-Protem enthaltenden Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon, beispielsweise ein humanes GATl-Protem.
Darüber hinaus ist ein z. B. wassriges Messmedium vorgesehen, in welchem die Primartrager und die Sekundartrager angeordnet werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primartragern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert.
Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.
Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberflache des Tragers abgeschiedene Material- schicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die Mate- πalschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstarke von etwa 10 bis 200 nm .
Das GATl-Protem kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form eingesetzt werden. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch unter- sucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiolo- gische oder gentechnisch initiierte Veränderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren .
Besonders vorteilhaft ist es, dass Pπmartrager eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primartragern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physika- lischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Primartrager .
Das vorangehende gilt auch für die in dem Primartrager vorgesehenen Wirkortkomplexe und das GATl-Protein . Hier sind Wirkortkomplexe und GATl-Proteine eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den jeweiligen Primartrager in etwa einheitlich sein.
Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von GATl-Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulieren, sind als potentielle Wirkstoffe, z.B. zur Behandlung von Epilepsie und verschiedenen kognitiven Störungen von gewerblichem Interesse. Auch waren Substrate des Proteins, die von diesem transportiert werden, interessante neue Moleküle.
Das erfindungsgemaße Vorgehen bietet folgende Vorteile: Die Messung der Enzymaktivität gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Einzelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich.
BEISPIEL 1: Vorbereitung des Sensorchips
Die Goldoberfläche wurde durch Einlegen in eine 1 mmol/l/l
Octadecylmercaptanlösung mercaptanisiert , mit 2-Propanol
(absolut) oder destilliertem Wasser gespült und getrocknet. Sie wurde dann mit Diphytanoyl-Phosphatidylcholin (in De- can) bedeckt und mit einem Anlagerungspuffer (140 mmol/1 K- gluconat, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes, pH 7/NMG, 2 mmol/1 DTT) überschichtet.
BEISPIEL 2: Herstellung der proteinhaltigen
MembranfragmentSuspension
Die Membranfragmente wurden nach folgendem Protokoll präpariert: Pro lGramm Zellpellet ImI Sucrose-Puffer (0,25 mol/1 Sucrose, 5 mmol/1 Tris, pH 7,5, ca. 2 mmol/1 DTT, PMSF*, Complete**); * 50 μl PMSF als gesättigte ethanolische Lösung auf 100 ml Puffer; ** Complete / Fa. Roche, eine Tablette pro 50ml Puffer. Zellen pottern bis homogene Masse entstanden ist (alternativ wurde auch eine Parr bomb einge- setzt), 10 min / 680g / 4°C; 10 min / 6100 g / 4°C; Über- stand Ih / 100.000 g / 4°C zentrifugieren; Pellet in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 aufnehmen, so dass eine sehr trübe Mischung entsteht; mit Zugabe von 70% Sucrose (in 5 mmol/1 Tris) auf 51,3% Sucrose einstellen, Zentrifugenrohrchen mit 44,4.%, 30,7% und 8,6% Sucrose in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 uberschichten; 1 h 40 min / 100.000 g / 4°C im Ausschwenkrotor zentrifugieren; Banden mit Pasteurpipette abnehmen und pelletieren in Anlagerungspuffer (siehe oben); 30 min / 150.000 g / 4°C; Pellets in Anlagerungspuffer aufnehmen.
Beispiel 3: Herstellung des GATl-Sensorchips
10 μl der Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 0,1- 1,0 mg ml"1) wurden auf dem Sensorchip aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) mkubiert.
Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 300-1000 nF cm"2, die Leitfähigkeit Gls bei ca. 10-100 nS cm"
2
Beispiel 4: Aktivitatsmessung an GATl-exprimierenden Memb- ranfragmenten
Die Durchflusszelle mit integriertem protembeladenem Sensorchip wurde zunächst mit Anlagerungspuffer (siehe oben, 200 μmol/1 DTT statt 2 mmol/1) durchspult. Danach folgte die nicht-aktivierende Losung (10 mmol/1 Valin, 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes pH 7/NMG, 200 μmol/1 DTT) und mittels elektromechamschem 3 /2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Losung (10 mmol/1 GABA, 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes pH 7/NMG, 200 μmol/1 DTT) umgestellt. Der Cotransport von Natrium, Chlorid und GABA fuhrt zu einem positiven Signal, da positive Ladungsträger zur Membran verschoben werden. Beispiel 5: Aktivitatsmessung ohne das Cosubstrat Natrium
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde in der aktivierenden und nicht-aktivierenden Losung 140 mmol/1 NaCl durch 140 mmol/1 KCl oder 140 mmol/1 Cho- lin-Cl ausgetauscht. Damit steht das Cosubstrat Natrium nicht mehr für den GABA-Transport zur Verfugung. Unter diesen ionalen Bedingungen kann kein Natrium-Chlorid-GABA- Cotransport stattfinden.
Beispiel 6: Aktivitatsmessung an Kontrollmembranen
Die Messungen wurden wie bei den GATl-expπmierenden Membranen durchgeführt. Dabei ergaben sich keine Signale beim Wechsel von mcht-aktivierender (ohne GABA) auf aktivierende Losung (mit GABA) .
Fig. 1 zeigt die Stromantwort des mit GATl beladenen
Biosensors auf einen GABA-Konzentrationssprung in
Ab- und Anwesenheit von Natrium.
Fig. 2 zeigt die Stromantwort des mit Kontrollmembranen beladenen Biosensors auf einen GABA- Konzentrationssprung .
Fig. 3 Stromantwort des mit GATl beladenen Biosensors auf einen GABA-Konzentrationssprung in unterschiedlichen Konzentrationen.
Die Abszisse der Figuren bezeichnet jeweils die Zeit t, wobei t=0 denjenigen Zeitpunkt angibt, bei welchem GABA in das System eingespult wird. Die Ordinate der Figuren bezeichnet also den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode gemessen wird. Dargestellt sind in Fig. 1 drei Messspuren A, B und C, die mit unterschiedlichen Messbedingungen in Bezug auf die Substratkonzentration an GABA korrespondieren.
Spur A der Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher die GATl- Proteineinheiten durch Zugabe von 10 mmol/1 GABA zum Zeitpunkt t=0 normal aktiviert ist, und zwar in Anwesenheit von 140 mmol/1 NaCl. Unter GABA-Transport werden mittels des GATl-Proteins Natrium- und Chloridionen über die Primartra- ger, z.B. über Membranfragmente oder Vesikel, auf die Bio- sensormembran und die Elektrode zu bewegt. Im Transportzyk- lus von GABA wird netto dabei positive elektronische Ladung über die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt. Dies ist am gemessenen positiven Stromsignal erkennbar.
Spur B in Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher 140 mmol/1 KCL statt NaCl verwendet wird. Ohne das Cosubstrat der Natriumionen, das beim Austausch von NaCl durch KCl nicht mehr für den GABA-Transport zur Verfugung steht, kann kein Natriumchlorid-GABA-Transport mehr stattfinden.
Spur C in Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher bei erneuter Anwesenheit von 140 mmol/1 NaCl mittels des GATl- Proteins Natrium- und Chloridionen über die Primartrager auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt werden. Dies ist analog Spur A in Fig. 1 am gemessenen positiven Stromsignal erkennbar.
Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, fuhrt der Cotransport von Natriumionen, Chloridionen und GABA zu einem positiven Signal, da nur so positive Ladungsträger zur Membran verschoben werden können.
Fig. 2 zeigt den gemäß einer anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I als Funktion der Zeit t, und zwar unter Verwendung von Kontrollmembranen, in denen kein GATl vorliegt. Beim Wechsel von nicht-aktivierender (ohne GABA) auf aktivierende Losung (mit GABA) ist kein über das Rauschen hinausgehendes Signal erkennbar. Dies liegt eben am Fehlen einer Ionentransportfunktion, die in den Messungen zu Fig. 1 durch GATl erzeugt oder vermittelt wurde .
In Fig. 3 sind vier Messspuren dargestellt, die mit unterschiedlichen Messbedingungen in Bezug auf die Substratkonzentration an GABA korrespondieren. Bei 10 mmol/1 GABA sind die GATl-Proteineinheiten normal aktiviert, bei 5 mmol/1 und noch starker bei 2,5 mmol/1 ist bereits eine deutlich erkennbare Absenkung des Maximums des gemessenen positiven elektrischen Stroms I(t) feststellbar. Bei der geringsten Konzentration von 0,5 mmol/1 liegt das Signal nur noch geringfügig über dem Grundrauschen. Zusammenfassend zeigt Fig. 3 somit die Relevanz der Anwesenheit von GABA für die Transportaktivitat der GATl-Emheiten .
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringe Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu anderen Techniken die Signalqualitat besser, und zwar im Sinne eines besseren Signal-RausehVerhältnisses .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomple- xes modifiziert, welcher ein GATl-Protem enthalt, mit den Schritten:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primartrager , welche den das GATl-Protein enthaltenden Wirkortkomplex, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des je- weiligen Primartragers enthalten,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primartrager am oder im Oberflachenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundartrager dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundartrager bevorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primartra- gern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und e- lektrisch isoliert ist oder wird,
(c) Bereitstellen mindestens eines potentiellen Wirkstoffkomplexes , (d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung- Bringen des potentiellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primartrager oder Teilen davon, und (e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potentiellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkort- komplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektrode als Sekundartrager,
wobei in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden :
(f) Einbringen des Sekundartragers mit den Pπmartragern in einen Anlagerungspuffer und Detektieren einer elektri- sehen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e) ,
(g) Einbringen des Sekundartragers mit den Pπmartragern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e) ,
(h) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des GATl-Proteins enthalt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfahiger und festkorperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primartragern bevorzugt elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkorperunterstutzten Membran, wel- che schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbmdung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosen- sorelektrode als Sekundartrager abdeckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer fest- korperunterstutzten Doppelschichtmembran oder Bilayer- membran ausgebildet wird oder ist.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primartrager jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon m nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primartrager jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizellare Struktur verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein GATl-Protein verwendet wird, das aus einem Gewebe eines Saugetiers, bevorzugt Hirn, Darm oder Niere, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das GATl-Protein aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet wird.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das GATl-Protein zumindest zum Teil im Primartrager eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist oder wird.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeugtes elektrisches Potenzial, welches jeweils erzeugt wird durch Ladungs- oder Stoff- transport oder -Verschiebung, Konformationsanderungen, Ligandenbindung, -anlagerung oder -freigäbe, oder einer Kombination davon.
11. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird:
- die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomple- xes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,
- die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon, - eine Konformationsanderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder
- eine beliebige Kombination dieser Prozesse.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium ein wassπges Messmedium verwendet wird und insbesondere eine wassπge Elektrolytlosung .
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) durch- gefuhrt werden durch:
- Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes , eines Teils oder einer Vorform davon,
- Austauschen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder - chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes , eines Teils oder einer Vorform davon.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundartrager und daran angelagerten Pπmartragern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefaß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinander folgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinander folgendes Austauschen des Messmediums, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spulen des Messraums.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (g) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundartra- gers mit den Primartragern in ein viertes oder Waschmedium.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (h) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
- bei welchem das erste Medium oder der Anlagerungspuffer
- K+,
- Cl" nicht oder in niedrigen Konzentrationen, insbesondere in niedrigeren Konzentrationen als im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium und als im dritten oder aktivierenden Medium
- gegebenenfalls Mg++,
- pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, enthalt,
- bei welchem das zweite oder nicht-aktivierende Medium - Na+,
- Cl",
- gegebenenfalls Mg++,
- pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, enthält, und
- bei welchem das dritte oder aktivierende Medium
- Na+,
- ei-,
- gegebenenfalls Mg++, - pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, sowie
- ein Substrat des GATl-Proteins , bevorzugt GABA zwischen 1 μmol/1 und 10 mmol/1 enthält.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium und insbesondere als zweites oder nicht-aktivierendes Medium und/oder besonders bevorzugt als drittes oder aktivierendes Medium Medien mit GABA verwendet werden, insbesondere mit einer Konzentration von etwa 1 μM bis 10 mmol/1.
20. Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex,
- welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, der ein GATl-Protein enthält, oder eines Teils davon modifiziert,
- welcher gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19 identifiziert ist.
21. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine bestimmte enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl-Protein enthält, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, mit Hilfe eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, - Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes , eines Teils und/oder eines Derivats davon,
- Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats,
- Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes , des Teils oder Derivats mit einer pharmazeutisch vertraglichen Tragersubstanz.
22. Testkit zur Durchfuhrung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit :
- mindes tens e inem Pπmartrage r ,
- einem Mes sbe re ich , - einem ersten Medium oder Anlagerungspuffer, einem zweiten oder mcht-aktivierenden Medium, einem dritten oder aktivierenden Medium zur Aufnahme eines potentiellen Wirkstoffkomplexes und
- weiterhin mindestens einem potentiellen Wirkstoffkomplex .
23. Screeningverfahren zum Identifizieren:
- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirk- stoffkomplexes , Teils oder Derivats davon,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils oder Derivats davon, - der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon oder
- einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Großen oder Eigenschaften durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/oder des Testkits gemäß Anspruch 22, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, ein Teil oder das Derivat davon eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl-Protein enthält, oder einen Teil davon modifiziert.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktivatoren oder Modulatoren einer enzymati- sehen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl- Protein enthält.
25. Verwenden des Testkits gemäß Anspruch 22, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl- Protein enthält.
26. Verwenden eines Arzneimittels, - welches gemäß dem Verfahren nach Anspruch 21 hergestellt wurde,
- zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition oder Modulation einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein GATl-Protein enthält.
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