WO2012073881A1 - 大建中湯のバイオアッセイ方法およびこれを用いる品質管理方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a bioassay method for Daikenchuto, and more specifically, using a cultured serotonin-producing cell, quantitatively evaluating the pharmacological activity value (serotonin releasing activity) of Daikenchuto, a Kampo preparation.
  • the present invention relates to a bioassay method and a quality control method for Daikenchuto using the same.
  • Chinese herbal medicine is a medicinal product blended with herbal medicines, and not all active ingredients are specified.
  • a single active ingredient does not exert its effect, it acts in a complex manner with multiple ingredients, so in order to guarantee its quality, a measuring method that can be evaluated as a whole preparation Is said to be necessary.
  • the US FDA herbal medicine guidance requires quality control by bioassay for products such as herbal medicine.
  • This quality control method includes a method for measuring all components that are thought to be related to medicinal effects and comprehensively evaluating them, and a bioassay for evaluating biological activity using biological materials.
  • Bioassays include in vivo tests and in vitro tests, but the in vivo test system has various limitations in terms of test facilities, test animals, and processing capacity. It was difficult to use for the quality evaluation of Chinese medicine.
  • in-vitro test systems do not require special facilities and stable test results can be obtained in a short period of time, so it is required to establish a bioassay method in this system.
  • an appropriate bioassay system has not always been found, and its establishment is awaited.
  • an object of the present invention is to provide a bioassay method based on a simple test tube test for Daikenchuyu, and to provide a more accurate quality control method for Daikenchuyu using this method.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • Daikenchuto and serotonin We conducted earnest research on the relationship.
  • Daikenchuto has a serotonin release promoting action on serotonin-producing cells, and by measuring the amount of released serotonin, the pharmacological activity value of Daikenchuto can be measured. It was found that this was possible, and that the quality control of Daikenchuto could be appropriately performed by using this bioassay system, and the present invention was completed.
  • the present invention adds a test sample containing Daikenchuto to cultured serotonin-producing cells, and then measures the serotonin content in the culture supernatant. Is the method.
  • the present invention evaluates the pharmacological activity under the same conditions of the reference preparation and the test preparation, which have clinically recognized pharmacological effects as Daikenchuto, by the bioassay method of pharmacological activity of Daikenchuto described above,
  • This is a quality control method for Daikenchuto preparations, characterized by evaluating the equivalence between a reference preparation and a test preparation.
  • the bioassay method of the present invention it is possible to measure the pharmacological activity value (serotonin releasing activity) of Daikenchuto by a simple in vitro test without any restrictions on test facilities, test animals, processing ability, etc.
  • this test by performing this test in an appropriate concentration range for evaluating quality, quality control with high accuracy can be performed for Daikenchuto.
  • Daikenchuto is generally a powdered extract of mixed herbal medicines having the composition shown in Table 1 (sometimes referred to as Kowi Daikenchuto). (Kouyi English name: maltose).
  • Daikenchuto which becomes the object of the bioassay method of the present invention
  • Daikenchuto formulation which is added to Daikenchuto and further added as a pharmaceutical additive and formulated into granules etc.
  • Examples of such a formulated Daikenchuto preparation include those marketed as ethical drugs such as TSUMURA Daikenchuto extract granules (medical use).
  • ingredients that are approved as additives for the above-mentioned pharmaceuticals include starch, lactose, sucrose, mannitol, carboxymethylcellulose, corn starch, inorganic salts and other excipients, disintegrants, surfactants, lubricants , Fluidity promoters, flavoring agents, colorants, fragrances and the like.
  • a test sample containing Daikenchuto is added to cultured serotonin producing cells, and the pharmacological activity value of Daikenchuto from the amount of serotonin released in the serotonin producing cells after the addition. Is to evaluate.
  • Examples of serotonin-producing cells used in the present invention include enterochromaffin cells.
  • This enterochromaffin cell is an endocrine cell and can produce and secrete a large amount of serotonin present in the living body. From the fact that 90% of the serotonin present in the living body is present in the enterochromaffin cells of the intestine, enterochromaffin cells of the intestine can be preferably used.
  • an enterochromaffin-like cell line capable of producing a certain stable serotonin can also be used.
  • enterochromaffin-like cell lines include RIN-14B cells derived from rat pancreatic cancer, QGP-1 cells derived from human pancreatic cancer, and KRJ-I cells derived from human small intestine carcinoid.
  • particularly preferred cell lines include RIN-14B cells because of their excellent proliferation ability.
  • serotonin-producing cells are cultured in a medium suitable for their growth, for example, a medium such as RPMI 1640 containing antibiotics, serum, etc., for example, for 1 to 3 days.
  • a medium suitable for their growth for example, a medium such as RPMI 1640 containing antibiotics, serum, etc., for example, for 1 to 3 days.
  • a test sample containing Daikenchuto is generally dissolved or suspended in a solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and added to the medium.
  • a solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO)
  • a known method can be used without particular limitation as long as it can measure the amount of released serotonin.
  • Preferred methods include enzyme immunoassay (EIA method) and HPLC. Can be mentioned.
  • the EIA method used in the present invention is a method of measuring the binding amount of an antigen-antibody reaction by attaching an enzyme to an antigen or antibody that undergoes a specific antigen-antibody reaction and measuring the activity of the enzyme.
  • a commercially available kit such as EIA serotonin kit (manufactured by Beckman Coulter) can be used.
  • the amount of sample charge, the type of analytical column, the diameter and length of the analytical column, the temperature of the analytical column, the composition of the mobile phase can be appropriately selected, and the conditions most suitable for the separation of serotonin may be selected. Such conditions are preferably such that the serotonin retention time (retention time) does not overlap with other detected substances.
  • the analytical column a commonly used column, for example, a column filled with ODS or the like, and a generally used electrochemical detector (ECD) or the like can be used as the detector.
  • a statistically significant reaction is preferably obtained in a concentration range (0 to 900 ⁇ g / mL) in which a concentration-dependent reaction is obtained as seen in the results of Example 1.
  • concentration range 90-900 ⁇ g / mL
  • the bioassay method of the present invention When evaluating the quality of Daikenchuto, which is a product, using the bioassay method of the present invention, first, the pharmacological activity value (serotonin releasing activity) of multiple lots of Daikenchuto that clinically had a pharmacological effect. ) And set the standard range based on that value. Next, by the same method, the pharmacological activity value (serotonin releasing activity) of the sample for quality test of Daikenchuto to be evaluated is measured. Then, the equivalence is evaluated based on whether or not the pharmacological activity value of the sample is within the set standard range, and quality control may be performed by setting an acceptable product as an acceptable product.
  • Example 1 Daikenchuto bioassay test (1) Preparation of test sample: The herbal medicine mixture having the blending ratio shown in Table 1 was extracted by heating at 100 ° C. for 1 hour with purified water in an amount 10 times the weight of the mixture, and powdered to obtain Kowi Daikenchuto extract powder. This Koui Daikenchuto extract powder was made into a 100 mg / mL concentration of DMSO suspension, and this was mixed at a ratio of 1: 9 with an 88.8 mg / mL concentration aqueous koji solution to obtain a 90 mg / mL concentration. A Daikenchuto solution was prepared. This was diluted with 0.1% BSA-Hanks buffer * to a concentration of 9 mg / mL, followed by sonication for 15 minutes to prepare a Daikenchuto test sample.
  • allyl isothiocyanate (AITC, Wako Pure Chemical Industries) was added to DMSO to prepare a DMSO solution of 100 mmol / L AITC.
  • BSA-Hanks buffer 1 g bovine serum albumin, 1 g glucose, 8 g sodium chloride, 400 mg potassium chloride, 47.9 mg sodium monohydrogen phosphate (anhydrous), 60 mg potassium dihydrogen phosphate in 1 liter of distilled water (Anhydrous), 46.8 mg magnesium chloride (anhydrous), 48.8 mg magnesium sulfate (anhydrous), 140 mg calcium chloride (anhydrous) were dissolved and adjusted to pH 7.2 to 7.4.
  • Rat pancreatic cancer cell line RIN-14B (manufactured by DS Pharma Biomedical) was added to RPMI 1640 medium (10 mmol / L HEPES, 1.5 g / L NaHCO 3 , 100 U / mL penicillin G) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). And 100 ⁇ g / mL streptomycin) to obtain serotonin-producing cells. The cells were collected using trypsin-EDTA solution.
  • Serotonin (5-HT) release test The serotonin-producing cells obtained in (2) above were dispensed at 3 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L / well in a 96-well flat bottom plate. After 72 hours of pre-culture, the culture supernatant was replaced with 0.1% BSA-Hanks buffer containing each test sample obtained in (1) above, and further 1 hour in a 5% carbon dioxide incubator. Cultured.
  • Test samples were serially diluted with 0.1% BSA-Hanks buffer containing 1% DMSO and added to the final concentrations of 27, 90, 270, and 900 ⁇ g / mL in the culture system. The final concentration of was 0.1%.
  • the positive control sample obtained in (1) above was added so that the final concentration was 100 ⁇ mol / L and the final concentration of DMSO was 0.1% in the culture system.
  • the culture supernatant was centrifuged at 320 g for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was used as a 5-HT concentration measurement sample (hereinafter referred to as “measurement sample”).
  • the measurement sample obtained in (3) above was added to the tube containing the acylating reagent, and 50 ⁇ L of the acylating buffer was further added, followed by vortexing until the reagent was dissolved.
  • the reaction was carried out for 30 minutes at room temperature under light-shielded conditions to obtain an acylation reaction solution.
  • a system to which no measurement sample was added was treated in the same manner as above and used as a control.
  • each acylation reaction solution is transferred to an appropriate well of a 96-well plate coated with an anti-5-HT antibody, and 200 ⁇ L of acetylcholinesterase (ACE) -5-HT conjugate is added at room temperature under light-shielding conditions. Incubated competitively for 3 hours with shaking in a plate mixer.
  • ACE acetylcholinesterase
  • the plate was washed 3 times with 300 ⁇ L / well to remove unbound substances, and then 200 ⁇ L / well of ACE substrate was added and left for 15 to 20 minutes. After confirming color development, 50 ⁇ L of a reaction terminator was added to stop the reaction, and the absorbance at 405 nm was measured. The result is shown in FIG.
  • the 5-HT analysis by HPLC was performed under the following conditions.
  • the 5-HT standard solution was prepared with a 0.1 mol / L acetic acid aqueous solution to which EDTA was added so that the final concentration was 100 mg / L.
  • HPLC analysis conditions Trace biological sample analysis system: HTEC-500 (EICOM) Data processor: EPC-300 (EICOM) Data analysis software: PowerChrom version 2.5.7 (eDAQ) Analytical column: EICOMMPAK CA-5ODS 2.1mm ⁇ ⁇ 150mm Precolumn: EICOM PREPAKSET-CA 3.0mm ⁇ ⁇ 4mm Mobile phase: 80% 0.1 M phosphate buffer (Na + ) pH 6 20% methanol 500mg / L 1-octane sulfonic acid soda (SDS) 50 mg / L EDTA ⁇ 2Na + Flow rate: 230 ⁇ L / min Analysis temperature: 25 ° C Setting applied voltage: +450 mV (+400 to +450 mV) vs. Ag / AgCl Working electrode: Graphite electrode WE-3G Gasket: GS-25 Analytical column: 80%
  • Daikenchuyu when evaluating the quality of Daikenchuto, there are almost no restrictions on test facilities, test animals, processing capacity, etc., and the test is possible, and further, by performing the test in an appropriate concentration range. , Daikenchuyu can be evaluated with high accuracy.
  • the present invention is highly advantageous in quality control of Kampo preparations because it is more economical than conventional Daikenchuto bioassay methods and can be easily evaluated for quality.

Abstract

　大建中湯について簡便な試験管内試験によるバイオアッセイ方法を提供し、更にこれを利用した大建中湯のより正確性の高い品質管理方法を提供することを目的とする。当該方法は、培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法並びにこのバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同等性を評価する大建中湯製剤の品質管理方法である。

Description

大建中湯のバイオアッセイ方法およびこれを用いる品質管理方法
　本発明は、大建中湯のバイオアッセイ方法に関し、更に詳細には、培養したセロトニン産生細胞を用い、漢方製剤である大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を定量的に評価しうるバイオアッセイ方法およびこれを用いた大建中湯の品質管理方法に関する。
　漢方薬は、生薬をブレンドした医薬品であり、その活性成分が全て特定されているわけではない。また、単一の活性成分のみで効果を発揮するわけではなく、多成分により複合的に作用するものであるため、その品質を保証するには、その製剤全体として評価をすることができる測定方法が必要であるとされている。実際、米国ＦＤＡの植物薬ガイダンスでは、漢方薬などの製品に関してバイオアッセイなどによる品質管理を求めている。
　この品質管理方法には、薬効に係わると思われる成分を全て測定し、それらを総合的に評価する方法と、生物材料を用いて生理活性を評価するバイオアッセイがある。前者の場合、測定にかかるコストや測定方法の確立の点で問題がある。一方、バイオアッセイには、生体内（in　vivo）試験と、試験管内（in　vitro）試験があるが、生体内試験の系は、試験施設、試験動物、処理能力等の点で種々の制約があり、漢方薬の品質評価に用いるには困難が伴っていた。
　一方、試験管内試験の系では、特殊な施設を必要とせず、安定した試験結果が短期間に得られるため、この系でバイオアッセイ法を確立することが求められている。しかし、それ自身が複数の有効成分を含む生薬を組み合わせた漢方薬については、常に適切なバイオアッセイ系が見出されているというものではなく、その確立が待たれている。
　従来、漢方薬である大建中湯の薬理効果に関する品質管理のためのバイオアッセイ方法として、既に大建中湯投与による腸平滑筋収縮を直接測定する方法（マグヌス法）が構築されている（非特許文献１）。
　しかし、このマグヌス法はラットから摘出した腸管を使用するため、品質評価のルーチン試験として実施するバイオアッセイ方法としては、使用性が悪く、また、感度、再現性等においても不十分であった。
「日医大医会誌」、第６巻（３）、第１２７－１２９頁（２０１０）、管　隼人および内田　英二
　従って本発明の課題は、大建中湯について簡便な試験管内試験によるバイオアッセイ方法を提供し、更にこれを利用した大建中湯のより正確性の高い品質管理方法を提供することである。
　本発明者らは、大建中湯の腸管運動亢進作用や腸管血流増加作用や、これらの作用とセロトニンの関与についての報告（非特許文献１）に着目し、大建中湯とセロトニンの関係に関し鋭意研究を行った。そしてその結果、大建中湯がセロトニン産生細胞に対して、セロトニン放出促進作用を有すること、および放出されるセロトニンの量を測定することにより、大建中湯の薬理活性価を測定することが可能であること、並びにこのバイオアッセイ系を利用することで、適切に大建中湯の品質管理を行うことができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法である。
　また本発明は、上記の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同等性を評価することを特徴とする大建中湯製剤の品質管理方法である。
　本発明のバイオアッセイ方法によれば、試験施設、試験動物、処理能力等の制約なく、簡単な試験管内試験により、大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定することが可能であると共に、品質を評価するために適切な濃度範囲で本試験をおこなうことにより、大建中湯について正確性の高い品質管理を行うことができる。
大建中湯濃度とセロトニン（５－ＨＴ）放出量の関係を示す図面である。 ＨＰＬＣによる、培養試料液中のセロトニンの測定結果を示す図面である。図中（ａ）は、大建中湯を添加しなかった場合のセロトニン（５－ＨＴ）放出を、（ｂ）は、大建中湯を９００μｇ／ｍｌ添加した場合のセロトニン（５－ＨＴ）放出を示す。
　大建中湯は、一般に表１の組成の混合生薬の抽出エキスを粉末化したもの（無コウイ大建中湯と称されることがある。）に、抽出エキスの８倍量程度の粉末飴（コウイ（膠飴）　英名：ｍａｌｔｏｓｅ）を配合したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　そして、本発明のバイオアッセイ法の対象になる大建中湯としては、大建中湯にさらに医薬品添加物として添加が認められている成分を加えて顆粒等に製剤化した大建中湯製剤も含まれる。このような製剤化した大建中湯製剤としては、例えば、ツムラ大建中湯エキス顆粒（医療用）のような医療用医薬品として市販されているものを挙げることができる。
　なお、上記の医薬品添加物として添加が認められている成分とは、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の賦形剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等が挙げられる。
　本発明の大建中湯のバイオアッセイ方法は、培養セロトニン産生細胞に大建中湯を含有する被験試料を添加し、添加後のセロトニン産生細胞におけるセロトニン放出量から大建中湯の薬理活性値を評価するものである。
　本発明で用いるセロトニン産生細胞の例として、エンテロクロマフィン細胞を挙げることができる。このエンテロクロマフィン細胞は、内分泌細胞であり、生体内に存在するセロトニンを大量に産生、分泌することができる細胞である。そして、生体内に存在するセロトニンの９０％が腸管のエンテロクロマフィン細胞内に存在しているという事実から腸管のエンテロクロマフィン細胞を好ましく用いることができる。
　さらに、上記セロトニン産生細胞としては、一定の安定したセロトニンを産生できるエンテロクロマフィン様の細胞株を用いることもできる。エンテロクロマフィン様の細胞株とは、たとえば、ラット膵臓癌由来のＲＩＮ－１４Ｂ細胞、ヒト膵臓癌由来のＱＧＰ－１細胞、ヒト小腸カルチノイド由来のＫＲＪ－Ｉ細胞等が挙げられる。このうち、特に好ましい細胞株としては、増殖性に優れる点でＲＩＮ－１４Ｂ細胞が挙げられる。
　本発明の大建中湯のバイオアッセイ方法は、まずセロトニン産生細胞を、その生育に適した培地、例えば、抗生物質、血清等を含むＲＰＭＩ１６４０等の培地で、例えば、１日間ないし３日間、３７℃において培養した後、リン酸緩衝液等で置換し、これに所定量の被験試料を加えた後、同じ温度で、更に２０分間から３時間培養した後、培地中へのセロトニン放出量を測定することにより行われる。
　大建中湯を含有する被験試料は、一般には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような溶媒に溶解ないし懸濁し、前記培地中に加えられる。
　また、セロトニン放出量を測定する方法としては、セロトニン放出量が測定できる方法であれば特に制約なく公知方法を利用できるが、好ましい方法としては、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）や、ＨＰＬＣ法が挙げられる。
　本発明で用いられるＥＩＡ法とは、特異的な抗原抗体反応をする抗原または抗体に酵素を付着させ、酵素の活性を測定することによって抗原抗体反応の結合量を測定する方法であり、具体的には例えば、ＥＩＡ　セロトニン・キット（EIA　serotonin　kit；ベックマン・コールター社製）等の市販のキットを用いて行うことができる。
　更に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によりセロトニン放出量を測定するにあたっては、試料のチャージ量、分析用カラムの種類、分析用カラムの直径及び長さ、分析用カラムの温度、移動相の組成、移動相流量等の条件は、適宜選択することができ、セロトニンの分離に最も適した条件を選択すればよい。このような条件としては、セロトニンのリテンションタイム(保持時間)が他の検出物と重ならないような条件が好ましい。なお、分析用カラムとしては、通常使用されるカラム、例えば、ＯＤＳ等を充填したカラム等、また検出器としては、一般に汎用される電気化学検出器（ＥＣＤ）等が使用できる。
　本発明のバイオアッセイ方法においては、実施例１の結果にみられるように濃度に依存した反応が得られる濃度範囲（０～９００μｇ／ｍＬ）において、さらに好ましくは統計学的に有意な反応が得られる濃度範囲（９０～９００μｇ／ｍＬ）において、同時に複数、好ましくは３点以上測定し、これから被験試料中の大建中湯の薬理活性価（セロトニン放出活性）を定量することが好ましいが、条件がほとんど変わらないのであれば、上記濃度範囲の濃度の大建中湯を含む試料で既に作製された検量線を使用して測定しても良い。
　本発明のバイオアッセイ方法により製品である大建中湯の品質評価を行う場合は、まず、臨床的に薬理効果が認められた大建中湯の複数ロットについて、その薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定し、その値に基づいて規格範囲を設定する。次いで、同じ方法により、評価すべき大建中湯の品質試験用サンプルについて薬理活性価（セロトニン放出活性）を測定する。そして、このサンプルの薬理活性値が、設定した規格の範囲内であるかどうかで同等性を評価し、同等と認められるものを合格品とすることで品質管理を行なえばよい。
　次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実　施　例　１
　　　大建中湯のバイオアッセイ試験：
（１）被験試料の調製：
　表１の配合割合の生薬混合物を、その混合物重量の１０倍量の精製水で１時間、１００℃で加熱抽出し、粉末化することにより無コウイ大建中湯エキス末を得た。この無コウイ大建中湯エキス末を１００ｍｇ／ｍＬ濃度のＤＭＳＯ懸濁液とし、これを、８８．８ｍｇ／ｍＬ濃度の膠飴水溶液に対して１：９の割合で混和し、９０ｍｇ／ｍＬ濃度の大建中湯溶液を調製した。これを０．１％ＢＳＡ－Ｈａｎｋｓ緩衝液＊で希釈して９ｍｇ／ｍＬ濃度としたのち１５分間の超音波処理を行い、大建中湯被験試料を調製した。
　また、陽性対照試料として、アリルイソチオシアネ－ト（ＡＩＴＣ、和光純薬工業）をＤＭＳＯに加え、１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＡＩＴＣのＤＭＳＯ溶液を調製した。
＊０．１％ＢＳＡ－Ｈａｎｋｓ緩衝液
　　　１リットルの蒸留水に１ｇウシ血清アルブミン、１ｇブドウ糖、８ｇ塩化ナトリウム、４００ｍｇ塩化カリウム、４７．９ｍｇリン酸一水素ナトリウム(無水)、６０ｍｇリン酸二水素カリウム(無水)、４６．８ｍｇ塩化マグネシウム(無水)、４８．８ｍｇ硫酸マグネシウム(無水)、１４０ｍｇ塩化カルシウム(無水)を溶解し、ｐＨ７．２～７．４に調製した。
（２）セロトニン産生細胞（ＲＩＮ－１４Ｂ細胞）の培養：
　ラット膵臓癌細胞株ＲＩＮ－１４Ｂ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ＨＥＰＥＳ、１．５ｇ／Ｌ　ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン　Ｇおよび１００μｇ／ｍＬ　ストレプトマイシン）中で継代培養し、セロトニン産生細胞とした。なお、細胞の回収にあたっては、トリプシン－ＥＤＴＡ液を用いた。
（３）セロトニン（５－ＨＴ）放出試験：
　上記（２）で得られたセロトニン産生細胞を、９６穴平底プレートに３×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌで分注した。７２時間の前培養を行なった後、培養上清を上記（１）で得た各被験試料を含む０．１％ＢＳＡ－Ｈａｎｋｓ緩衝液に置換し、５％炭酸ガスインキュベーターの中で更に１時間培養した。
　被験試料は、１％ＤＭＳＯを含む０．１％ＢＳＡ－Ｈａｎｋｓ緩衝液で段階希釈して培養系中で最終濃度２７、９０、２７０、９００μｇ／ｍＬとなるように添加し、培養系でのＤＭＳＯの最終濃度は０．１％とした。また、陽性対照群では、被験試料に変え、上記（１）で得た陽性対照試料を、培養系中で最終濃度１００μｍｏｌ／Ｌ、ＤＭＳＯの最終濃度が０．１％となるように加えた。
　最後に、培養上清を３２０ｇで、５分間、４℃で遠心処理し、その上清を５－ＨＴ濃度測定用試料（以下、「測定用試料」という）とした。
（４）ＥＩＡ法によるセロトニン（５－ＨＴ）測定：
　ＥＩＡ法による５－ＨＴ放出測定は、ＥＩＡ　セロトニン・キット（ベックマン・コールター社製)を用い、製品の添付プロトコールに準じて行った。
　すなわち、アシル化試薬の入ったチューブに、上記（３）で得た測定用試料を加え、さらにアシル化バッファー５０μＬを添加して試薬が溶解するまでボルテックスにて攪拌した。室温、遮光条件下で３０分間反応を行い、アシル化反応液を得た。測定試料を加えない系でも上記と同様に処理し、コントロールとした。
　次に抗５－ＨＴ抗体がコートされた９６穴プレートの適当なウェルに、各アシル化反応液２０μＬを移し、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣＥ）－５－ＨＴ結合体２００μＬを加えて、室温、遮光条件下、プレートミキサーで振盪しながら３時間、競合的にインキュベートした。
　キットに添付のウォッシュバッファーを用い、３００μＬ／ｗｅｌｌで３回プレートを洗浄し、未結合のものを除いた後、ＡＣＥ基質を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて１５～２０分放置した。発色を確認した後、反応停止剤５０μＬを加えて反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１に示す。
　図１の結果に示すように、２７、９０、２７０、９００μｇ／ｍＬ濃度の大建中湯を加えた測定試料では、無添加のコントロールに比べ、明らかに上清中の５－ＨＴ量が多く、しかも濃度依存的であり、検量線が形成しうるものであった。また、陽対照のＡＩＴＣを加えた測定試料も、コントロールに比べ、明らかに高い５－ＨＴ濃度を示し、大建中湯がセロトニン産生細胞に作用したことによる５－ＨＴであることが示された。
（５）ＨＰＬＣによるセロトニン（５－ＨＴ）測定：
　次に、（３）で得られた測定用試料のうち、９００μｇ／ｍＬ大健中湯のものと、コントロールのものの培養試料液について、ＨＰＬＣを用い、これに含まれる５－ＨＴを検出した。その結果を図２の（ａ）および（ｂ）に示す（５－ＨＴの保持時間は、（ａ）で１６.２７分、（ｂ）で１６．１１分である）。
　なお、ＨＰＬＣによる５－ＨＴ分析は、以下の条件でおこなった。また、５－ＨＴ標準液は、終濃度１００ｍｇ／Ｌ濃度となるようにＥＤＴＡを添加した０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液で調製した。
　ＨＰＬＣ分析条件
　　　微量生体試料分析システム：ＨＴＥＣ－５００（ＥＩＣＯＭ）
　　　データ処理装置：ＥＰＣ－３００（ＥＩＣＯＭ）
　　　データ解析ソフトウェア：ＰｏｗｅｒＣｈｒｏｍ　ｖｅｒｓｉｏｎ
　　　　　　　　　　　　　　　２．５．７（ｅＤＡＱ）
　　　分析カラム：ＥＩＣＯＭＰＡＫ　ＣＡ－５ＯＤＳ
　　　　　　　　　２．１ｍｍΦ×１５０ｍｍ
　　　プレカラム：ＥＩＣＯＭ　ＰＲＥＰＡＫＳＥＴ－ＣＡ
　　　　　　　　　３．０ｍｍΦ×４ｍｍ
　　　移動相：８０％　０．１Ｍ　リン酸緩衝液（Ｎａ＋）ｐＨ６
　　　　　　　２０％　メタノール
　　　　　　　５００ｍｇ/Ｌ　１－オクタンスルホン酸ソーダ（ＳＤＳ）
　　　　　　　５０ｍｇ／Ｌ　ＥＤＴＡ・２Ｎａ＋
　　　流速：２３０μＬ／ｍｉｎ
　　　分析温度：２５℃
　　　設定加電圧：＋４５０ｍＶ（＋４００～＋４５０ｍＶ）　ｖｓ
　　　　　　　　　Ａｇ／ＡｇＣｌ
　　　作用電極：グラファイト電極　ＷＥ－３Ｇ
　　　ガスケット：ＧＳ－２５
　　　分析カラム：８０％
　図２の結果から、ＨＰＬＣによる測定でもセロトニン放出活性が測定できることがわかった。
　本発明によれば、大建中湯の品質評価をおこなう際に、試験施設、試験動物、処理能力等の制約がほとんどなく、試験が可能であり、更に適切な濃度範囲で試験をおこなうことにより、大建中湯について正確性の高い品質評価を行うことができる。
　従って本発明は、従来の大建中湯のバイオアッセイ方法に比べ、経済性が高く、簡単に品質評価を行うことができるので、漢方製剤の品質管理において極めて有利なものである。

Claims (5)

  1. 　培養セロトニン産生細胞に、大建中湯を含有する被験試料を添加し、次いで培養上清中のセロトニン含量を測定することを特徴とする大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
  2. 　セロトニン産生細胞が、エンテロクロマフィン様細胞である請求項第１項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
  3. 　セロトニン産生細胞が、ＲＩＮ－１４Ｂ細胞、ＱＧＰ－１細胞およびＫＲＪ－Ｉ細胞から選ばれる細胞株である請求項第１項または第２項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法。
  4. 　請求項１ないし３の何れかの項記載の大建中湯の薬理活性のバイオアッセイ方法により、大建中湯として臨床的に薬理効果が認められた基準製剤と被検製剤を同一条件で薬理活性を評価し、基準製剤と被検製剤の同一性を評価することを特徴とする大建中湯製剤の品質管理方法。
  5. 　大建中湯の濃度として、９０～９００μｇ／ｍＬの範囲でバイオアッセイ方法を行う請求項４記載の大建中湯製剤の品質管理方法。
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