DE69534702T2

DE69534702T2 - Verfahren zur erhöhung der expression von endogenen peptiden tragenden mhc klasse i molekulen

Info

Publication number: DE69534702T2
Application number: DE69534702T
Authority: DE
Inventors: A. Wilfred JEFFERIES; Reinhard Gabathuler; S. Gregor REID; Gerassimos Kolaitis
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: University of British Columbia
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-22
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2015-09-23
Also published as: US20120135031A1; EP0783573B1; US6361770B1; EP0783573A1; JPH10505755A; US7378087B2; DE69534702D1; US20100080776A1; US7994146B2; WO1996009380A1; US20030082195A1; JP4418965B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Steigerung der Immunantwort eines Säugetiers auf eine Tumorzelle, die niedrige oder nicht nachweisbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, welche endogene Peptide tragen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Antwort der cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) ist ein Hauptbestandteil des Immunsystems, der bei der Immunüberwachung und Zerstörung infizierter oder maligner Zellen und eindringender Organismen, die auf ihren Oberflächen Fremdantigene exprimieren, aktiv ist. Der Ligand des antigenspezifischen T-Zellrezeptors ist ein Komplex, der aus einem Peptidfragment eines Fremdantigens besteht, das an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden ist. Cytotoxische T-Lymphozyten erkennen insbesondere ein Peptid, das an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden ist.
MHC-Klasse-I-Moleküle werden gewöhnlich an der Zelloberfläche als ternäre Komplexe exprimiert, die durch eine schwere Kette mit 46 kD, eine als β₂-Mikroglobulin (β₂m) bezeichnete leichte Kette mit 12 kD und ein Peptid gebildet werden, das aus 8 bis 10 Aminosäuren besteht (van Bleek, G.M. und S.G. Nathenson, Nature 348, 213, 1990; Zhang, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8403, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257: 927, 1992; und Latron, F. et al., Science 257: 964, 1992). Die Bildung des ternären Komplexes beinhaltet wahrscheinlich den Transport von Peptiden, die durch Proteinabbau im Cytoplasma erzeugt werden, in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums (ER) (Nuchtern, J.G. et al., Nature 339: 223, 1989; Yewdell, J.W. und J.R. Bennink, Science 244: 1072, 1989; und Cox, J.H. et al., Science 247, 715, 1990). Die Untersuchung der Zelllinien-Mutanten, welche wegen ihrer niedrigen Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen an der Zelloberfläche ausgewählt wurden, hat Einblicke in die molekularen Ereignisse gewährt, die für eine Antigenprozessierung erforderlich sind. Diese Untersuchungen ermöglichten die Identifizierung von zwei Genen, die im MHC-Bereich lokalisiert sind und die Proteine der Familie der ATP-Bindungs-Cassetten (ABC) codieren. Diese als TAP-1 und TAP-2 bezeichneten Gene sind am Transport von Peptiden aus dem Cytoplasma in das Lumen des ER beteiligt (Deverson, E.V. et al., Nature 348: 738, 1990; Trowsdale, J. et al., Nature 348: 741, 1990; Spies, T. et al., Nature 348; 744, 1990; Monaco, J.J. et al., Science 250; 1723, 1990; Spies, T. und R. DeMars; Nature 351: 323, 1991; Bahram, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10094, 1991; Spies, T. et al., Nature 355: 644, 1992; Kelly, A. et al., Nature 355: 641, 1992; Powis, S. H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1463, 1992; und Colonna, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3932, 1992). Zwei andere Gene, die mit MHC zusammenhängen, LMP-2 und -7 (Monaco, J.J. und McDevitt, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79; 3001) sind Komponenten des Proteasoms, eines cytoplasmatischen multikatalytischen Proteasekomplexes, der wahrscheinlich für einige Aspekte des Proteinabbaus für die Antigenprozessierung verantwortlich ist (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991; Brown, M.G. et al., Nature 353: 355, 1991; Glynne, R. et al., Nature 353: 357, 1991; Martinez, C.K. und J.J. Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly, A. et al., Nature 353: 667, 1991; Yang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4928, 1992, Goldberg, A.L. und K.L. Rock, Nature 357: 375, 1992).
Die Maus-Lymphomzelllinienmutante RMA-S exprimiert niedrige Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche verglichen mit den Wildtyp-RMA-Zellen (Ljunggren, H.-G. et al., J. Immunol. 142: 2911, 1989; und Townsend, A. et al., Nature 340: 443, 1989). Mit Influenza-Virus infizierte RMA-S-Zellen präsentieren Influenza-Peptide im Zusammenhang mit D^b-Molekülen ineffizient, und werden durch spezifisches CTL nur schwach erkannt (Townsend A. et al., Nature 340: 443, 1989). Die Transfektion mit dem mutmaßlichen Transportergen TAP-2 komplementiert diese Defizienz (Powis, S. J. et al., Nature 354: 528; und Attaya, M. et al., Nature 355: 647, 1992). Das endogene TAP-2-Gen der RMA-S-Zellen enthält Befunden zufolge eine Punktmutation, die ein Stop-Translations-Codon einbringt, das ein unvollständiges und defektes TAP-2-Protein hervorbringt (Yang, Y et al., J. Biol. Chem. 267: 11669, 1992). Trotz des defekten TAP-2-Proteins in RMA-S-Zellen, überbrücken antigene Peptide aus vesikulärem Stomatitis-Virus den Defekt und werden durch K^b-Moleküle in RMA-S-Zellen spezifischen CTL präsentiert (Esquivel, F. et al., J. Exp. Med. 175: 163, 1992; und Hosken, N.A. und M. J. Bevan, J. Exp. Med. 175: 719, 1992). Das VSV-Nucleokapsid (N)-Peptid, VSV-N-52-59 ist Befunden zufolge das Hauptpeptid, das durch K^b-Moleküle auf VSV-infizierten Zellen präsentiert wird (van Bleek, G.M. und S.G. Nathenson, Nature 348: 213, 1990). Das Vorhandensein des Wildtyp-TAP-1-Proteins in RMA-S-Zellen kann für eine Translokation des VSV-N-52-59-Peptids zum ER-Lumen hinreichend sein (Powis, S. J. et al., Nature 354: 528, 1991; Attaya, M. et al., Nature 355: 647, 1992; und Yang et al., J. Biol. Chem. 267: 11669, 1992). Alternativ braucht das VSV-N 52-59-Peptid keinen funktionellen Transporter zum Transport in das Lumen des ER. Die Expression der minigen-codierten Viruspeptidepitope in T2-Zellen (Zweerink, H.J. et al., J. Immunol. 150: 1763, 1993) und In-vitro-Translation und -Translokation mit Mikrosomen aus T2-Zellen (Lévy, F. et al., Cell 67: 265, 1991) unterstützen diese Behauptung.
Bei einer gesonderten Klasse von antigenprozessierenden Varianten sind der Zusammenbau und die Oberflächenexpression der MHC-Klasse-I-Moleküle ganz durch IFN-γ induzierbar (Klar, D. und G.J. Hämmerling, EMBO J. 8: 475, 1989). Beispielsweise erfolgt in der Kleinzelllungen-Karzinomzelllinie CMT.64 die Erkennung durch Influenzavirus-spezifische CTL nicht, wenn sie nicht durch IFN-γ induziert wird (Sibille, C. et al., Eur. J. Immunol. 22: 433, 1992). Die sehr niedrige Menge sämtlicher Proteasomen-Komponenten, die in nicht-induzierten CMT.64-Zellen vorhanden sind, ist wahrscheinlich für ihren Phänotyp verantwortlich (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991). Exogene Influenza-Peptide können an D^b-Moleküle auf CMT.64-Zellen binden und die Erkennung durch influenzaspezifische CTL komplementieren (Sibille, C. et al., Eur. J. Immunol. 22: 433, 1992). Es wurde zudem gefunden, dass die exogen zu diesen Zellen zugefügten β₂m- und die VSV-N-52-59-Peptide die Erkennung durch VSV-spezifische CTL, restringiert auf K^b, komplementieren (Jefferies W.A. et al., 1993, J Immunol. 151: 2974). Die Menge β₂m und der schweren Ketten, die in diesen Zellen synthetisiert werden, können das Ausmaß der MHC-Klasse-I-Expression auf der Zelloberfläche einschränken (Jefferies et al., siehe oben, 1993). Eine Fehlfunktion der mutmaßlichen Peptid-Transporter und/oder bei der Erzeugung des Peptids kann für den CMT.64-Phänotyp verantwortlich sein, der einen Mechanismus zur Abwärtsregulation der MHC-Klasse-I-Expression repräsentiert, eine Eigenschaft, die vielen Karzinomen gemeinsam ist.
Restifo, N.R. et al., (J. Exp. Med. 177: 265–272, 1993) untersuchten die Antigen-Prozessierungs-Effizienz von 26 verschiedenen Humantumorlinien mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus (Vac) zur transienten Expression des K^d-Moleküls. Drei Zelllinien, alles Kleinzelllungenkarzinome, konnten durchweg keine endogen synthetisierten Proteine zur Präsentation an K^d-restringierte Vac-spezifische T-Zellen prozessieren. Pulse-Chase-Experimente zeigten, dass MHC-Klasse-I-Moleküle nicht durch die Zelllinien aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) zur Zelloberfläche transportiert wurden. Northern-Blot-Analyse der Zellen ergaben niedrige bis nicht nachweisbare Mengen mRNAs für die MHC-codierte Proteasomen-Komponenten LMP-7 und LMP-2 sowie die mutmaßlichen Peptid-Transporter TAP-1 und TAP-2.
Momburg et al. (Nature 360: 174–177; 1992) offenbaren, dass die Transfektion von T2-Zellen (die kein TAP-1 und TAP-2 exprimieren) nur mit Ratten-TAP-1-cDNA die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen nicht veränderte, die endogene Peptide auf der Oberfläche der T-Klasse trugen. Die Transfektion nur mit TAP-2 führte zu einem leichten Anstieg der Expression, aber wenn TAP-1- und TAP-2-Rattentransporterproteine in T2-Zellen transfiziert wurden, wurde die Expression auf Spiegel wiederhergestellt, die 2- bis 3mal höher als in T1-Zellen waren. Sie schlossen aus ihren Ergebnissen, dass TAP-1 und TAP-2 zur Antigen-Präsentation benötigt wurden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben überraschend entdeckt, dass trotz der mehrfachen antigenprozessierenden Defizienzen in CMT.64-Zellen, TAP-1 in die Zellen transfizierte, und es allein zur Induktion der CTL-Erkennung VSV-infizierter Zellen in Abwesenheit der IFN-γ-Induktion ausreichte. Es wurde bedeutenderweise gezeigt, dass TAP-1 unabhängig von TAP-2 beim Peptid-Transport wirkt, da die transfizierten Zellen für die TAP-2-Expression negativ blieben. Es wurde auch gezeigt, dass TAP-1 allein spezifische Peptide an die Stelle des MHC-Zusammenbaus abgab, so dass sich stabile Komplexe bilden konnten, die anschließend zur Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert wurden, so dass eine Immunüberwachung durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) ermöglicht wurde.
Es wurde zudem gezeigt, dass einige Peptide im ER nur durch TAP-2 transloziert werden. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass TAP-2 allein bei Fehlen von TAP-1 zur Steigerung der Prozessierung und Präsentation des Influenza NP366-374-Peptids ausreicht.
Die Erfinder haben bedeutenderweise gezeigt, dass Mäuse, denen hohe Mengen CMT.64-Zellen injiziert wurden, die mit TAP-1 oder TAP-2 transfiziert worden waren, erhöhte Überlebensraten und signifikant gesenkte Pathologie und Metastase zeigen, verglichen mit Mäusen, denen Wildtyp-CMT.64-Zellen injiziert wurden.
Die Erfindung lehrt daher die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Immunantwort eines Säugetiers erhöht auf eine Tumorzelle, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, die T-Zellrezeptorinteraktive Antigene tragen und geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, wobei die medizinische Zusammensetzung der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthält, in die Tumorzelle und der Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen dient, so dass die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die T-Zellrezeptorinteraktive Antigene tragen, erhöht wird und die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers ermöglicht wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die medizinische Zusammensetzung ein Vaccinia-Virus. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Immunantwort eine cytolytische T-Lymphozyten-Antwort.
Die Anmeldung schlägt daher eine Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls vor, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Steigerung der Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide auf der Oberfläche einer Zielzelle tragen, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und niedrige oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren. Die medizinische Zusammensetzung dient der Einführung von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die TAP-1 unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kodiert, in die Zielzelle und zur Expression von TAP-1 in der Zielzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird. Die Zielzelle ist vorzugsweise eine Tumorzelle, die zudem eine Defizienz in den Proteasomen-Komponenten aufweist, am stärksten bevorzugt eine Kleinzell-Lungenkarzinomzelle. Bei einer Ausführungsform werden Prozessierung und Präsentation der endogenen Peptide, die das Motiv RGYVYQGL tragen, das auf K^b restringiert ist, durch Einführung eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls erhöht. Bei einer zweiten, nicht-erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Prozessierung und Präsentation endogener Peptide, die das an H-2D^b bindende Motiv ASNENMETM haben, durch Einführung eines TAP-2 kodierenden Nukleinsäuremoleküls erhöht.
Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Nukleinsäuremolekül mit einer TAP-1 kodierenden Sequenz und ein zweites Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ein Antigenpeptid, vorzugsweise ein T-Zellrezeptorinteraktives Antigen, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kodiert, in die Zielzelle eingeführt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines rekombinanten Virusvektors, umfassend eine TAP-1 kodierende Nukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, die einen Antigenpeptid-Vektor kodiert, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Zelloberflächen-Expression eines MHC-Klasse-I-Moleküles, das endogene Peptide trägt, in einer Tumorzelle, die geringe oder nicht- erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert und niedrige oder nicht-erfassbare Mengen der Transporterproteine TAP-1 und TAP-2 exprimiert.
Die Anmeldung lehrt zudem weiter eine medizinische Zusammensetzung zur Erhöhung der Immunreaktion eines Säugetiers auf eine Tumorzelle, die niedrige oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, welche endogene Peptide tragen. Die medizinischen Zusammensetzung dient der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, in die Tumorzelle und der Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers, insbesondere die Erkennung durch cytolytische T-Zellen, erlaubt.
Bei einer Ausführungsform wird das Nukleinsäuremolekül in die Tumorzelle in ein Vaccinia-Virus eingeführt. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst das Einführen eines zusätzlichen Nukleinsäuremoleküls in die Tumorzelle, wobei das zusätzliche Nukleinsäuremolekül umfasst eine Sequenz, die ein Antigenpeptid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors codiert, und das Exprimieren des Antigenpeptids in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation der MHC-Klasse-I-Moleküle erhöht wird, die das Antigenpeptid tragen, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers, am stärksten bevorzugt die cytolytische T-Lymphozyten des Säugetiers, erlaubt. Bei einer bestimmten Ausführungsform kann das Virus als Impfstoff zur Erhöhung der Immunantwort auf das Antigenpeptid verwendet werden.
Die Anmeldung beschreibt zudem die Herstellung tumorspezifischer T-Zellen, die Anti-Tumoreigenschaften aufweisen, umfassend das Entfernen von Tumorzellen aus einem Individuum; Einführen eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in die Tumorzellen, wobei die medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 1 verwendet wird; Einpflanzen der Tumorzellen in das Individuum oder ein Säugetier mit einem wiederhergestellten Immunsystem des Individuums; und Ernten tumorspezifischer T-Zellen. Die tumorspezifischen T-Zellen können als Therapeutikum in vivo in dem Individuum verwendet werden.
Diese und andere Aspekte der Erfindung werden anhand der folgenden eingehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. Zudem werden verschiedene Veröffentlichungen herangezogen, die hiermit durch Bezugnahme ganz aufgenommen sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt:
1A, Histogramme, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten RMA- und RMA-S-IFN-γ-induzierten (+) oder uninduzierten Zellen, CMT.64-Zellen (abgekürzt: C);
1B, Histogramme, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen (abgekürzt: C);
2, ein Autoradiogramm, die Menge von β₂m, synthetisiert in RMA-, RMA-S und IFN-γ-induzierten (+) oder nicht induzierten (–) CMT.64 Zellen;
3, ein Histogramm, die Wirkung von β₂m auf die CTL-Antwort gegen CMT.64-Zellen, die mit Vaccinia- und Vaccinia-β₂m-Rekombinante (V-Vb2), Vaccinia und VSV (V-VSV) oder Vaccinia-β₂m und VSV (Vb2-VSV) superinfiziert sind, wobei das Insert die synthetisierte β₂m-Menge nach der Immunfällung mit dem anti-hβ₂m-Kaninchenserum zeigt;
4, Autoradiogramme, den intrazellulären Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle, D^b und K^b;
5, Autoradiogramme, den intrazellulären Transport freier und zusammengebauter Formen von K^b-Molekülen in uninduzierten und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen;
6, ein Histogramm, die VSV-N 52-59-Peptid-Dosisantwort bei der CTL-Erkennung für CMT.64-Zellen (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) und RMA-S-Zellen (RMA-S);
7, eine Northern-Blot-Analyse von Cytoplasma-RNA aus RMA-, RMA-S-, CMT.64-IFN-γ-induzierten und nicht-induzierten Zellen;
8 die zweidimensionale Gelanalyse von Proteasomenkomponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64 IFN-γ-induzierten oder nicht induzierten Zellen;
9 CMT 64 (CMT), und CMT 64, transfiziert mit TAP-1 (CMT TAP 1), infiziert mit oder ohne VSV für 8 Std. bei einer MOI von 5, oder behandelt mit N52-59-Peptid für 2 Std. bei 500 Pm (50% Dosisantwort);
10 TAP-Genexpressionsprofile von CMT.64 und CMT64/r1-4;
11, eine Durchflusscytometrienanalyse, dass die TAP-1-Expression zur Erhöhung der Mengen von K^b und D^b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen hinreicht;
12 Pulse-Chase-Analyse von K^b und D^b-Molekülen aus CMT.64- und TAP-1-transfizierten CMT.64-Zellen (CMT64/r1-4);
13 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte CMT.64 Zellen (SMT-r1.4) effizient Antigen an VSV-spezifische CTL präsentieren;
14 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen effizient Antigen an VSV-spezifische CTL präsentieren;
15 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte Klone effizient Antigen an VSV-spezifische CL präsentieren;
16, ein Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach Influenza-Infektion erkannt werden, und CMT-64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, nicht erkannt werden;
17, ein Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach Influenza-Infektion erkannt werden, und CMT.64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, nicht erkannt werden;
18, eine Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, CMT.64-Zellen, die mit beiden TAP-Genen der Ratte transfiziert wurden, nach einer Influenza-Virusinfektion erkannt werden;
19 ein Histogramm, dass HSV-infizierte Zellen durch spezifische CTL unabhängig von der Expression von Ratten-TAP1 und/oder TAP-2-Transportergenen erkannt werden; und
20, eine Schaubild, das Überleben von C57BI/6- und Balb/C-Mäusen, denen 5 × 10⁵ CMT.64 oder CMT.12.12-Zellen injiziert wurden.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie vorstehend erwähnt haben die Erfinder überraschend gezeigt, dass das TAP-1-allein, in der Abwesenheit von TAP-2 zur Erhöhung der Prozessierung und der Präsentation der VSV-Peptide an die intrazelluläre Stelle des MHC-Zusammenbaus ausreicht, so dass stabile Komplexe aus MHC-Klasse-I-Molekülen und endogenem Peptid gebildet, an die Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert werden können. Sie zeigten auch, dass nur TAP-2 in Abwesenheit von TAP-1 zur Erhöhung der Prozessierung und der Präsentation des Influenza-NP366-374-Peptids ausreicht.
Die Erfindung betrifft folglich die Verwendung einer Nukleinsäure, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide auf der Oberfläche einer Zielzelle tragen, erhöht, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, und geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Trartsporterproteine exprimiert. Die medizinische Zusammensetzung dient der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthält, in die Zielzelle und zur Expression von TAP-1 in der Zielzelle unter geeigneten Bedingungen, so dass die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird.
Zielzellen, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren, können durch Verfahren des Standes der Technik ausgewählt werden. Eine Zielzelle kann beispielsweise mit einem rekombinanten Virusvektor infiziert werden, wie VSV, und durch VSV-spezifische cytolytische T-Zellen auf Lyse untersucht werden. Die FACS-Analyse kann ebenfalls zur Erfassung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche einer mutmaßlichen Zielzelle verwendet werden. Die Biosynthese und der intrazelluläre Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen kann ebenfalls biochemisch charakterisiert werden. Endo-H beispielsweise, das N-verknüpfte Oligosaccharide nur spaltet, wenn sie in der High-Mannose-Form vorliegen, die für Proteine, die im ER und cis-Golgi-Komplex vorkommen, charakteristisch ist, können zum Messen des intrazellulären Transports verwendet werden. Pulse-Chase-Methodik kann ebenfalls zur Bestätigung von Zielzellen verwendet werden, die geringe Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren. Die vorstehenden Verfahren sind in den Beispielen hier beschrieben. Siehe ebenfalls Restifo, N.P. et al., siehe oben.
Beispiele für Zellen, die niedrige Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren, können von Kolon-, Brust-, Lungenmesotheliom- und Lungenkrebs mit Kleinzellhistologie hergeleitet werden (siehe Restifo, N.P. siehe oben).
Zellen, die geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren, können durch Untersuchung auf mRNA, die diese Proteine codiert, beispielsweise mittels Northern-Blot-Analyse, wie in den Beispielen hier beschrieben, erfasst werden. Beispiele für Zellen, die niedrige Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, sind Tumorzellen, die von Lungenkrebs mit Kleinzellhistologie hergeleitet sind.
Zielzellen können neben der Expression geringer oder nicht erfassbarer Mengen der Transporterproteine TAP-1 und TAP-2, geringe oder nicht erfassbare Mengen von einer oder mehreren Komponenten des Proteasoms exprimieren, beispielsweise LMP-7 und LMP-2.
Beispiele für endogene Peptide, deren Expression mit den erfindungsgemäßen Verfahren erhöht werden kann, umfassen Antigene, die mit cytolytischen T-Zellen wechselwirken und diese aktivieren, beispielsweise virale Antigene, wie das VSV-N52-59-Peptid, Influenza NP 366–374 und tumorasssoziierte Antigene. Die hier beschriebenen Untersuchungen legen nahe, dass endogene Peptide mit dem Motiv ASNENMETM, die an D^b binden, von TAP-2 transportiert werden und endogene Peptide mit dem Motiv RGYVYQGL, die an K^b binden, von TAP-1 transportiert werden. Daher kann die Erhöhung der Expression der vorherigen endogenen Peptide nach den hier beschriebenen Verfahren erzielt werden mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-2 kodierende Sequenz enthält, und die Erhöhung der Expression von Letzterem kann erzielt werden durch Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz enthält.
Das Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, kann leicht mit Techniken des Standes der Technik synthetisiert werden. Eine TAP-1 kodierende Sequenz umfasst eine Sequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz kodiert, wie sie offenbart ist in Trowsdale, J. et al., Nature 348: 741, 1990 und in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US91/06105, veröffentlicht am 19. März 1992. Ein Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-1 kodierende Sequenz umfasst, kann isoliert und sequenziert werden, beispielsweise durch Synthese von cDNAs, aus RNA und mit der raschen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE, Frohman, et al., 1988) mit Oligonukleotiden, die für TAP-1 spezifisch sind und Analyse der Sequenz der Klone, die nach der Amplifikation erhalten werden. Oligonukleotide, die spezifisch für TAP-1 sind, können identifiziert werden, indem die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit bekannten TAP-1-Sequenzen verglichen werden. Nukleinsäuremoleküle, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und die TAP-1 kodieren, können ebenfalls durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Die TAP-1 kodierende Sequenz kann ebenfalls mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
Einige der Verwendungen, die hier vorgeschlagen werden, verwenden Nukleinsäuremoleküle, die Sequenzen enthalten, welche verkürzte nicht-funktionelle Formen von TAP-1 kodieren. Verkürzte nicht-funktionelle Formen von TAP-1 können identifiziert werden, indem Anteile des TAP-1-Gens deletiert werden, so dass Fragmente erhalten werden. Solche Fragmente sollten mit den TAP-1 oder TAP-2-Sequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind so stringent, dass sie Spezifität schaffen, die Anzahl von Fehlpaarungen reduzieren und dennoch hinreichend flexibel sind, dass sie die Bildung stabiler Hybride in einer akzeptablen Rate ermöglichen. Diese Bedingungen sind dem Fachmann geläufig und sind beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Die Fähigkeit der verkürzten Formen von TAP-1 und TAP-2 zum Transport von endogenen Peptiden kann mit den hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die TAP-1 kodiert, können auf bekannte Weise in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden, der eine gute Expression des Proteins oder eines Teils davon gewährleistet. Mögliche Expressionsvektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, so lange der Vektor mit der verwendeten Zielzelle kompatibel ist.
Es wird erwogen, dass die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der eingeführten Sequenz enthalten. Geeignete Transkriptions- und Translationselemente können hergeleitet werden von einer Vielzahl von Quellen, und dazu gehören Bakterien-, Pilz-, Viren-, Säugetier- oder Insekten-Gene. Die Selektion geeigneter Transkriptions- und Translationselemente hängt ab von der ausgewählten Zielzelle, wie nachstehend erörtert, und kann leicht vom Durchschnittsfachmann bewerkstelligt werden. Beispiele für solche Elemente umfassen: einen Transkriptionspromotor und -Enhancer oder RNA-Polymerasebindungssequenz, eine Ribosomenbindungssequenz, wie u.a. ein Translationsinitiationssignal. Zudem können je nach der ausgewählten Wirtszelle und dem eingesetzten Vektor andere genetische Elemente, wie ein Replikationsursprung, zusätzliche DNA-Restriktionsstellen, Enhancer und Sequenzen, die die Induzierbarkeit der Transkription verleihen, in den Expressionsvektor eingeführt werden. Es wird auch erwogen, dass die nötigen Transkriptions- und Translationselemente vom nativen TAP-1-Gen, TAP-2-Gen und/oder ihren flankierenden Bereichen zugeführt wird.
Die Nukleinsäuremoleküle können auch ein Reportergen enthalten, das die Selektion transformierter oder transfizierter Wirtszellen erleichtert. Beispiele für Reportergene sind Gene, die ein Protein, wie β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase oder ein Immunglobulin oder einen Abschnitt davon, wie den Fc-Abschnitt eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reportergen IacZ. Die Transkription des Reportergens wird überwacht durch Konzentrationsänderungen des Reporterproteins, wie β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase. Dies ermöglicht das Sichtbarmachen und Untersuchen auf die Expression von TAP-1.
Nukleinsäuremoleküle, die eine TAP-1 kodierende Sequenz umfassen, können in die Zielzelle über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingebracht werden. Verfahren zur Transformation, Transfektion usw. von Wirtszellen zur Expression von Fremd-DNA sind Stand der Technik (siehe beispielsweise Itakura et al., US-Patent 4,704,362; Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929–1933, 1978; Murray et al., US-Patent Nr. 4,801,542; Upshall et al., US-Patent 4,935,349; Hagen et al., US-Patent 4,784,950; Axel et al., US-Patent 4,399,216; Goeddel et al., US-Patent 4,766,075; und Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2te Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind).
Geeignete Expressionsvektoren zum Steuern der Expression in Säugetierzellen umfassen gewöhnlich einen Promotor, sowie andere Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen. Allgemeine Promotoren umfassen SV40, MMTV, Metallothionein-1, Adenovirus Ela, CMV, Immediate Early, Immunglobulin Schwere-Ketten-Promotor und Enhancer und RSV-LTR. Protokolle zur Transfektion von Säugetierzellen sind dem Fachmann geläufig.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Nukleinsäuremolekül in die Zielzelle in einem viralen Vektor, vorzugsweise einem Vaccinia-Virus-Vektor, am stärksten bevorzugt attenuiert, eingebracht. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Vaccinia-Viren umfassen P7.5 (Cochran, M.A. et al., 1985, J. Virol. 54:30), P11 (Bertholet, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2096), CAE-1 (Patel, D.D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9431).
Das Nukleinsäuremolekül kann in eine nicht-essentielle Stelle eines Vaccinia-Virus-Vektors eingeführt werden. Diese nicht-essentiellen Stellen sind bekannt und beispielsweise beschrieben in Perkus et al., 1986, Virology: 285; Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3411 und; Weir und Moss, 1983, J. Virol. 46: 530). Rekombinante Viren, die TAP-1 exprimieren, können leicht mit Techniken des Standes der Technik identifiziert werden, die beispielsweise in Moss, B. 1992, (Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158: 25) erörtert sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ein antigenes Peptid, vorzugsweise ein pathogenes Peptid, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, in die Zielzelle eingebracht.
Wie vorstehend erwähnt, haben die Erfinder gezeigt, dass TAP-1 allein die Expression von Komplexen aus MHC-Klasse-I-Molekülen und endogenem Peptid auf der Oberfläche von Zielzellen steigern kann, wodurch die Zielzellen gegenüber der Immunüberwachung durch CTL anfällig sind.
Folglich stellt die vorliegende Anmeldung eine medizinische Zusammensetzung bereit, welche die Immunantwort eines Säugetiers auf eine Tumorzelle erhöht, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert und die geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimiert. Die medizinische Zusammensetzung dient dem Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, in die Tumorzelle und dem Exprimieren von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und Präsentation von einer oder mehreren endogenen Peptiden erhöht wird, wodurch die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform dient die medizinischen Zusammensetzung dem Einbringen eines zusätzlichen Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine Sequenz, die ein Antigenpeptid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, und dem Exprimieren des Antigenpeptids in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Präsentation und die Prozessierung des Antigenpeptids ermöglicht wird, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt.
Die Erfindung betrifft zudem die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Herstellung von tumorspezifischen T-Zellen, die Anti-Tumoreigenschaften besitzen. Dies umfasst die Entfernung der Tumorzellen aus einem Individuum; Einbringen eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in die Tumorzellen; Einpflanzen der Tumorzellen in das Individuum oder ein Säugetier mit einem wiederhergestellten Immunsystem des Individuums; und Ernten der tumorspezifischen T-Zellen. Es wird angenommen, dass bei einer Ausführungsform das Nukleinsäuremolekül ebenfalls sowohl TAP-1 als auch TAP-2 kodieren kann oder dass separate Nukleinsäuremoleküle, die TAP-1 und TAP-2 kodieren, in die Tumorzellen eingebracht werden können. Die tumorspezifischen T-Zellen können als Therapeutikum in vivo in dem Individuum verwendet werden. Verfahren wie sie in Restifo, N.P. et al., J. Exp. Med. 175: 1423–1431 beschrieben sind, können zur Herstellung spezifischer T-Zellen verwendet werden, deren In vivo-Antitumoreigenschaften Tumorzellen verwenden, die mit IFN-γ transfiziert sind.
Anpassende Immuntherapiemodelle können zur Bestätigung des Nutzens des Präparates gegen etablierte nicht-modifizierte Tumorzellen in vivo verwendet werden.
Die Erfindung schlägt auch vor, dass die Nukleinsäuremoleküle, die TAP-1 und TAP-2 oder nur TAP-1 kodieren, zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Pathogen oder einen Tumor und zur Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere metastatischen Kleinzellenlungenkarzinomen, in rekombinante Virusvektor-Impfstoffe eingebracht werden können. Man erwartet, dass diese Impfstoffe besonders geeignete Anwendung beispielsweise bei Säugetieren, einschließlich Menschen, finden, die keine Immunantwort auf bestimmte virale oder Tumor-Antigene hervorbringen können, wobei ihre HLA-Zusammenstellung keine angemessen Prozessierung und Präsentation des relevanten Antigenpeptids ermöglicht. Zum Beispiel zur Verwendung bei Personen oder Tumorzellen, denen Komponenten des Antigenpräsentationssystems fehlen, wie TAP-1, TAP-2 und Proteasomen-Komponenten, wird vorgeschlagen, dass die Nukleotidsequenzen, die TAP-1 und TAP-2 kodieren, getrennt verwendet werden können oder zusammen aufgenommen werden können, und zwar entweder unter der Kontrolle gesonderter Promotoren oder unter der Kontrolle des gleichen Promotors.
Impfstoffe aus rekombinantem Vaccinia-Virus können mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Der pJS5-Shuttler-Vektor, der zwei Early/Late-Verbindungpromotoren enthält, kann zur gleichzeitigen Expression von TAP und dem relevanten Antigen in einer infizierten Zelle verwendet werden. Das oder die TAP-Gene können hinter einen Promotor kloniert werden, und das Protein oder Peptid kann hinter den zweiten Promotor kloniert werden, oder in ein zweites Vakzin. TAP-1 kann hinter einen Promotor kloniert werden, und TAP-2 kann hinter den zweiten Promotor kloniert werden. Die klonierten Gene können vom Thymidin-Kinasegen flankiert sein. Der pJS-TAP-Antigenvektor kann in eine vacciniainfizierte Zelle transfiziert werden, so dass die homologe Rekombination zwischen der Thymidinkinasesequenz in Vaccinia und dem klonierten Shuttle-Vektor auftreten kann, was entweder ein rekombinanten Vacciniavirus ergibt, das TAP und das Antigen enthält, oder ein rekombinantes Vacciniavirus, das TAP-1 und TAP-2 enthält, was es ermöglicht, dass bestimmte Peptide transportiert und präsentiert werden können.
Die vorliegende Beschreibung schlägt auch die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung vor, die die Abstoßung eines transplantierten Gewebes von einem Empfängertier hemmt, umfassend die Modifikation, Eliminierung oder Maskierung der Expression von TAP-1, TAP-2 oder TAP-1 und TAP-2 in Zellen des Gewebes, so dass die endogene Antigenprozessierung und Präsentation auf der Oberfläche der Zellen des Gewebes gehemmt wird, was eine T-Lymphozytenvermittelte Antwort in dem Tier bewirkt. Die Expression von TAP-1, TAP-2 oder TAP-1 und TAP-2 können mittels TAP-1, TAP-2 und/oder TAP-1 und TAP-2-Antisense modifiziert, eliminiert oder maskiert werden. MHC-Klasse-I-Moleküle können auch aus den Zellen des Transplantatgewebes eliminiert werden, und verkürzte Formen von TAP-1, TAP-2 und/oder TAP-1 und TAP-2 können zur Konkurrenz mit den funktionellen Transportern verwendet werden, was zur Abwärtsregulation der Expression von TAP-1 und/oder TAP-2 führt.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen keinesfalls einschränkend sein.
BEISPIELE
Die folgenden Materialien und Methoden wurden bei den in den Beispielen 1 bis 8 aufgeführten Untersuchungen verwendet.
Tiere und Viren
C57BI/6-Mäuse wurden in der Züchtungsabteilung der Universität von British Columbia gezüchtet. Die Mäuse waren 6 bis 12 Wochen alt und wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care gehalten. VSV wurde auf Vero-Zell-Einzelschichten gezüchtet. VSV und eine Human-β₂m (hβ₂m)-Vaccinia-Rekombinante wurden freundlicherweise von Dr. J. Yewdell zur Verfügung gestellt.
Zelllinien und Antikörper
CMT.64-Zellen (H-2b) wurden freundlicherweise von Dr. L.M. Franks zur Verfügung gestellt (Franks, L.M. et al., 1976, Cancer, Res. 36: 1049). RMA und RMA-S-Zellen wurden in DMEM gehalten, das mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 20 mM Hepes, 2 mM Glutamin, und Antibiotika supplementiert war. Die verwendeten mAKs waren folgende: 142-23.3 anti H-2 K^b, 28-11-5s anti H-2 D^b (α1 + α2), 28-14-8s anti H-2 D^b (α3) und BBM.1 gegen Human-β₂m (Brodsky, F.M. et al., 1979, Eur. J. Immunol. 9: 536). Ein Kaninchen-Antiserum gegen hβ₂m (Bikoff, E.K. et al., 1991, Nature 354: 235) gegen Exon 8 von H-2K^b (Williams, D. et al., 1989, J. Immunol. 142: 2796) und gegen Ratten-Proteasom (Brown, M.G. et al., 1991, Nature 353: 357) wurden ebenfalls verwendet.
Transfektion
Die Transfektion von CMT.64-Zellen mit cDNA aus Ratten-TAP-1 in dem pHb-Apr-1-neo-Expressionsvektor (von Dr. G. Butcher zur Verfügung gestellt) wurde durch Lipofektion (Lipofectin, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit Hilfe von 10 μg DN erzielt A. Die Selektion erfolgte in 1 mg/ml G418 (Gibco BRL). Positive Klone wurden durch Northern-Blotting selektiert und gescreent zur Expression des Ratten-TAP-1-Gens. Die mit einem repräsentativen Klon erhaltenen Ergebnisse sind beschrieben (siehe 9). Als negative Kontrollen wurden Klone, erhalten aus einer Vektor-DNA-Transfektion durch Northern-Blotting analysiert. Die mit einer repräsentativen Klon erhaltenen Ergebnisse sind beschrieben (siehe 9).
Durchflusscytometrieanalyse
Zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen wurde fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-(FACS^®)-Analyse (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) verwendet. RMA-, RMA-S-, und CMT.64-Zellen wurden mit oder ohne rekombinantes Maus-gamma-Interferon (IFN-γ) bei 150–300 Units/ml (Genzyme Cytokine Research Products) für 48 Std. behandelt. Die Zellen wurden gesammelt und über Nacht in Medium ohne FCS, mit VSV-N 52-59-Peptid (50 μM) und/oder hβ₂m (2,5 μg) inkubiert. Peptide wurden von der Peptidsyntheseabteilung der University of Victoria (Victoria, Block-Copolymer, Canada) erhalten. Die Zellen wurden anschließend aus der Kultur entfernt, gewaschen und mit einer 1:50 Verdünnung von 142-23.3 Ascites oder 200 μl Zellkulturüberstand von 28-11-5s- und 28-14-8s-Zellen für 45 min auf Eis inkubiert. Nach zwei Waschschritten wurden die Zellen mit 100 μl einer 1:20 Verdünnung von Ziege-anti-Kaninchen- oder Ziege-anti-Maus-FITC-konjugiertem Zweitantikörper für weitere 45 min auf Eis inkubiert. Die Proben wurden dann in Paraformaldehyd (1,5% in phosphatgepufferter Salzlösung) fixiert und auf einem FACScan^®-Zellsortierer mit dem FACScan^®-Programm (Becton Dickinson & Co.) fixiert. Die in der Tabelle 1 aufgeführten Werte sind lineare Ausdrücke, die den Durchschnitt von 5000 Zellen veranschaulichen. Der korrigierte Wert (minus dem Wert ohne Erstantikörper) ist aufgeführt.
Zellmarkierung, Pulse-Chase-Experimente, Immunfällung, Isoelektrische Fokussierung und SDS-PAGE.
Die Zellen wurden in MEM-Medium ohne Methionin 1 Std. vor dem Markieren gewaschen und mit 150 μCi/ml ³⁵S-Methionin für 1 Std. oder wie angegeben markiert. Für die Pulse-Chase-Experimente wurden die Zellen 15 min markiert, und dann mit normalem Medium gechased, das einen Überschuss an kaltem Methionin enthielt. Markierte Zellen wurden mit 1 ml 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), das 0,12 M NaCl, 4 mM MgCl₂ und 1 % Nonidet P40, löslich gemacht, und Phenylsulfonylfluorid (PMSF, ein Protease-Inhibitor) wurde auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml vor der Verwendung zugegeben. Nach 15 min auf Eis wurde teilchenförmiges Material durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde zur Immunfällung von markierten Antigenen verwendet. Markierte löslich gemachte Antigene wurden zuerst mit 2 μl normalem Kaninchenserum für 45 min bei 4°C, gefolgt von 50 μl Protein-A-Sepharose (1:1 in Solubilisierungspuffer) für weitere 45 min bei 4°C vorgeklärt. Protein-A-Sepharose wurde durch eine schnelle Zentrifugation entfernt. Der vorgeklärte Überstand wurde mit dem geeigneten Antikörper oder Immunserum für 1 Std. bei 4°C umgesetzt. 35 μl Protein-A-Segpharose wurde zugegeben, und die Inkubation für weitere 30 min fortgesetzt. Nach der Zentrifugation wurden die Perlen zweimal mit 0,2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5, 0,15 M, NaCl und 2 mM EDTA, einmal mit 0,2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 M NaCl, 2 mM EDTA und schließlich mit 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 gewaschen. Eindimensionale isolektrische Fokussierung erfolgte wie zuvor beschrieben in Celis, J.E. et al., (1990, Electrophoresis 11: 989). SDS-PAGE erfolgte wie beschrieben in Kvist, S. et al. (1982, Cell 29: 61).
CTL-Antwort gegen VSV-infizierte, IFN-γ-induzierte Zellen
RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen wurden mit oder ohne IFN-γ bei 200 Units pro ml für 48 Std. behandelt. Sie wurden anschließend 3x mit PBS gewaschen und mit VSV bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 min in 0,5 ml Medium für 1 Std. behandelt. Die Kulturen wurden dann in insgesamt 3 ml Wachstumsmedium für weitere 4 bis 8 Std. (wie angegeben) inkubiert, so dass die Infektion weiterlaufen konnte. Einzelne Zellsuspensionen wurden mit 100 μCi ⁵¹Cr pro 10⁶ Zellen für 2 Std. in RPMI 1640, supplementiert mit -L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in Abwesenheit von fötalem Rinderserum (FBS) und Natriumbicarbonat, behandelt. Alternativ wurden die CMT.64-Zellen mit Vaccinia (V) und/oder Vaccinia-b2m (Vb2) bei einer MOI von 5 für 5 Std. infiziert, gefolgt von einer Superinfektion mit VSV (MOI, 5) für weitere 4 Std. Die Zellen wurden 3x gewaschen und anschließend bei 10⁴ Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit der Effektor-Population in Verhältnissen von 100 bis 12,5 inkubiert. Scheininfizierte Zellen wurden als negative Kontrollen verwendet. Die Effektor-CTL-Population wurde erzeugt durch Immunisieren von C57bl/6-Mäusen mit VSV bei 5 × 10⁶ – 1 × 10⁷ TCID₅₀ in die Pfotenballen und Ohren. An Tag 5 nach der Immunisierung wurden die abführenden Lymphknoten (retropharyngeal und popliteal) geerntet und die Kulturen bei 4 × 10⁶ Zellen pro ml in einem Gesamtvolumen von 5 ml in Platten mit 6 Vertiefungen gestartet. Das Kulturmedium bestand aus RPMI-1640, supplementiert mit 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol (ME), 10% hitzeinaktiviertem FBS, Natriumpyruvat, Penicillin, Streptomycin, L-Glutamin, HEPES, Natriumbicarbonat, und 50% NCTC-109. Die Kulturen wurden 3 Tage bei 37°C und 5% CO₂ in Abwesenheit von exogener Stimulation inkubiert. Die ⁵¹Cr-Freisetzung wurde durch einen Compugamma-Zähler (Model 1282 CS; LKB Instruments, Gaithersburg, MD) gemessen, und die spezifische Cr-Freisetzung berechnet als [(experimentell – Medienkontrolle)/(gesamt – Medienkontrolle)] × 100%. Die spontane Freisetzung überschritt niemals 17% der Maximal-Freisetzung.
RNA-Extraktion und Northern-Analyse
Gesamt-Zell-RNA wurde aus Zelllinien mit Guanidiniumisothiocyanat (GITC) hergestellt. Kurz gesagt wurden die Zellen in 4 M GITC lysiert, dann durch ein Cäsiumchloridkissen zentrifugiert (130000 × g für 16 Std. bei 23°C). Nach der Ethanolfällung wurde die gereinigte RNA in DEPC behandeltem H₂O resuspendiert. 10 μg jeder Probe wurde auf ein Agarosegel, das 2,2 M Formaldehyd enthielt, aufgetragen und aufgetrennt. Das Gel wurde auf Hybond N (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) geblottet und vor der Hybridisierung mit UV-Licht fixiert. Die ³²P-markierten Sonden, die zur Hybridisierung verwendet wurden, waren wie folgt: MTP1 und MTP2 (TAP-1 bzw. 2, die freundlicherweise von Dr. Geoff Butcher zur Verfügung gestellt wurden), hergestellt durch Random-Priming, und ein für β-Aktin spezifisches Oligonukleotid, welches durch terminale Transferase markiert wurde. Die Hybridisierung erfolgte bei 42°C in einem Puffer, der 0,4 M Na₂HPO₄, 50% Formamid und 7% SDS enthielt. Mehrere Waschschritte wurden bei 42°C unter Bedingungen steigender Stringenz durchgeführt, und die Filter über Nacht einem X-OMAT AR-Film (KODAK) exponiert.
BEISPIEL 1
Vergleich der Phänotypen von CMT.64- und RMA-S-Zellen
Die Kleinzelllungenkarzinomlinie CMT.64 exprimierte und baute MHC-Klasse-I-Moleküle Befunden zufolge auf der Zelloberfläche nach der IFN-γ-Behandlung zusammen (Klar D. und Hammerling, 1989, EMBO J. 8: 475; Sibille, C. et al, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 433; und Jefferies W.A. et al., 1993, J. Immunol. 151: 2974).
Zum Verständnis der molekularen Defizienz bei der Antigenprozessierung von CMT.64-Zellen wurden die kontrastierenden Phänotypen der CMT.64-Zellen gegen RMA-S-Zellen analysiert. Die CTL-Erkennung von VSV-infizierten RMA-, RMA-S-, CMT.64- IFN-γ-induzierten oder uninduzierten Zellen wurde im Allgemeinen nach den im Methodikteil hier beschriebenen Verfahren untersucht. Insbesondere wurden die Zielzellen mit oder ohne IFN-γ für 48 Std. vor der Infektion mit VSV behandelt, und die Ergebnisse sind in der 1 gezeigt. Tafel A in der 1 veranschaulicht ein repräsentatives Experiment mit RMA- und RMA-S-Zellen als Ziele, wohingegen Tafel B das äquivalente Experiment mit CMT.64-Zellen (abgekürzt: C) ist. Sämtliche Zellen wurden mit VSV bei einer MOI von 10 für 4 Std. infiziert. IFN-γ-Behandlung ist in der 1 nach der Bezeichnung der Zelllinie mit einem +–Zeichen vermerkt. Die spontane Freisetzung überschritt 15% nicht.
VSV-infizierte RMA-S-Zellen werden so effizient wie die Wildtyp-RMA-Zellen mit oder ohne IFN-γ-Behandlung erkannt, im Vergleich zu VSV.64-Zellen, die nicht durch spezifische CTL erkannt werden, wenn nicht durch IFN-γ induziert (1B). Man beachte, dass RMA-S-, RMA- und CMT.64-Zellen gleichermaßen eine Infektion mit VSV erlaubten, wie durch die Zahl der infektiösen Partikel angezeigt, nach der Infektion, die durch einen TCID₅₀-Assay gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). Daher haben nicht-induzierte CMT.64-Zellen eine andere oder zusätzliche Defizienz zu dem funktionell defekten Peptid-Transportergen TAP-2 in RMA-S-Zellen.
BEISPIEL 2
Wirkung von exogenem und endogenem Peptid auf die Phänotypen von CMT.64 und RMA-S-Zellen
Vorhergehende Experimente haben gezeigt, dass die Behandlung von mutierten Zellen mit exogenen Peptiden und/oder mit Human-β₂m leere Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche stabilisieren kann (Townsend, A. et al. 1989, Nature 340: 443; Vitiello, A., et al., 1990, Science 250: 1423; und Ljunggren, H, -G. et al., 1990, Nature 346: 476). RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die uninduziert oder mit IFN-γ induziert waren, wurden über Nacht mit 50 μM exogenen Peptiden VSV-N 52-59 in Gegenwart oder in Abwesenheit von Human-β₂m behandelt. VSV-N-52-59-Peptide und β₂m steigern synergistisch die Expression des K^b-konformationsspezifischen Epitops, das durch 142.23.3-mAK (Tabelle 1) auf RMA- und RMA-S-Zellen erkannt wird. VSV-N 52-59-Peptide beeinflussen spezifisch die Stabilität und die Konformation der K^b-Moleküle und haben keine Wirkung auf D^b-Moleküle. Human-β₂m bindet an K^b- und D^b-Moleküle, was durch BBM.1 (Anti- Mensch-β₂m-mAK) erfasst wird, und scheint die schweren Ketten zu stabilisieren, bevor sie an der Zelloberfläche zerfallen. Eine stabilisierende Wirkung wurde nicht nach der CMT.64-Behandlung mit Peptiden oder β₂m allein beobachtet. Zusätzliche Behandlung der CMT.64-Zellen mit IFN-γ war für eine starke Expression der K^b- und D^b-konformationsspezifischen Epitope auf der Zelloberfläche erforderlich (Tabelle 1). Daher exprimieren CMT.64-Zellen viel geringere Mengen "leerer" Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche als RMA-S-Zellen.
Vorhergehende Arbeiten haben gezeigt, dass die Anwesenheit von β₂m und Peptiden in dem Lumen des ER notwendig ist für einen effizienten Zusammenbau und Zelloberflächenexpression der MHC-Klasse-I-Moleküle (Rock, K. et al., 1991, Cell 65: 611). Die 2 zeigt die Menge von β₂m, die in RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die IFN-γ induziert oder uninduziert waren, synthetisiert wurden. Die Zellen wurden für 2 Std. mit ³⁵S-Methionin markiert, lysiert, mit einem Kaninchen-anit-hβ₂m-Serum immungefällt, und durch SDS-PAGE analysiert. Die radioaktiven Proteine wurden nach 6 Std. Exposition gegenüber einem XAR-Film erfasst. Es wurden CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt (+) oder nicht (–) behandelt waren, RMA- und RMA-S-Zellen verwendet (2). Die Wanderung des Molekulargewichtsmarkers ist auf der linken Seite von 2 angegeben.
Der 2 zufolge exprimieren CMT.64-Zellen eine niedrige Menge endogenes β₂m (2, Spur 1). IFN-γ- induzierte CMT.64.Zellen exprimieren eine viel höhere Menge β₂m, die vergleichbar ist mit der Menge, die in RMA- und RMA-S-Zellen exprimiert wird (2, Spuren 2–4).
Zur Untersuchung der Wirkung von β₂m in CMT.64-Zellen wurde ein rekombinantes Vaccinia-Virus zur Steigerung der Menge an endogenem β₂m verwendet. Die Wirkung von β₂m auf die CTL-Antwort gegen CMT.64-Zellen ist in der 3 gezeigt. Infizierte CMT.64-Zellen wurden mit Vaccinia- und Vaccinia-β₂m-Rekombinante (V-Vb2), Vaccinia und VSV (V-VSV), oder Vaccinia-β₂m und VSV (Vb2-VSV) ind FBS-freiem Medium (MOI 3) für bis zu weiteren 12 Std. superinfiziert. Bei dem Einsatz in 3 ist die synthetisierte Menge von β₂m nach Immunfällung mit dem anti-hβ₂m-Kaninchenserum gezeigt. CMT.64-Zellen, die mit dem Peptid VSV-N52-59 bei 500 pM für 2 Std. (CMT + p) behandelt wurden, wurden als positive Kontrolle verwendet, wohingegen scheinbehandelte CMT.64-Zellen (CMT+---) als negative Kontrolle verwendet wurden. Die freigesetzte Radioaktivität ist der Durchschnitt von vierfachen Vertiefungen. Die spontane Freisetzung überschritt 16% nicht.
Wie in 3 gezeigt stellte eine Erhöhung der Menge von β₂m, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus synthetisiert wurde, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen nicht wieder her. Daher induziert eine steigende Expression von β₂m nicht die Präsentation von VSV-Peptiden im Zusammenhang der K^b-Moleküle. Der CMT.64 antigenprozessierende Phänotyp wird nicht von der niedrigen Menge an endogenem β₂m verursacht.
BEISPIEL 3
Intrazellulärer Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle D^b und K^b
Der Transport der K^b- und D^b-Moleküle wurde untersucht nach einer Pulse-Chase-Markierung von CMT.64-, RMA- und RMA-S-Zellen, und SDS-PAGE-Analyse des immungefällten Materials (für K^b wurde 142.23.3-mAK verwendet, und für D^b wurde 28-14-8s, ein α3-spezifischer mAK, verwendet). Der intrazelluläre Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle, D^b und K^b, ist in der 4 gezeigt. Die Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin markiert und in einem Überschuss von kaltem Methionin für die in Std. angegebenen Zeiten im Oberteil von 4 gechased. Löslich gemachte Antigene wurden mit 142.23.3-mAKs für K^b oder 28-14-8s-mAKs für D^b immungefällt. Die Behandlungen sind oben angegeben, und die Wanderung der Molekulargewichtsmarker ist auf der linken Seite von 15 angegeben. Coimmunfällung der schweren Ketten (46 kD) und β₂m (12kD) wird für alle Zellen beobachtet, außer für CMT.64-nicht-induzierte Zellen. Radioaktive Proteine wurden nach 8 Tagen Exposition für RMA-S-Zellen und 4 Tagen für RMA- und CMT.64-Zellen einem XAR-Film ausgesetzt.
Trotz einer ähnlichen Menge von K^b-Molekülen, die in RMA- und RMA-S-Zellen synthetisiert wurden (4, 0 Std. Chase-Dauer), werden nur geringe Menge K^b zu einer höhermolekularen Form prozessiert, die das Ausmaß des Transport anzeigt, der für die Oberflächenexpression von K^b in RMA-S-Zellen verantwortlich ist. Die prozessierte Form ist gegenüber Endoglycosidase H-Spaltung resistent (Daten nicht gezeigt), was den Transport aus dem ER anzeigt. Die Beobachtung, dass viel mehr β₂m mit K^b-Molekülen als mit D^b-Molekülen in RMA-S-Zellen immungefällt wird (4 ) zeigt, dass der mAK 142.23.3 nur die zusammengebaute Form, schwere und leichte Ketten der K^b-Moleküle erkennt, wohingegen der mAK 28-14-8s die α3-Region der D^b-Moleküle erkennt. Die Anwesenheit eines funktionellen TAP-1-Proteins in RMA-S-Zellen (Yang, Y. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 11669) kann ausreichen, dass einige Peptide die ER-Membran durchqueren und eine kleine Anzahl K^b-Moleküle binden, was es ihnen ermöglicht, zur Zelloberfläche zu wandern. Peptide mit einer niedrigeren Affinität für K^b-Moleküle können an Moleküle binden und dabei unterstützend wirken, dass diese zusammengebaut werden und zur Zelloberfläche wandern, wo sie dissoziieren. Viel weniger reife prozessierte D^b-Moleküle wurden in RMA-S-Zellen nach 4 Std. Chase erfasst (4). Dies kann eine niedrigere Affinität von D^b für β₂m anzeigen und/oder, dass weniger Peptide für die D^b-Bindung verfügbar sind. In RMA-Zellen wurden die K^b-Moleküle innerhalb von 1 Std. prozessiert. Zum Vergleich wurden die D^b-Moleküle langsamer prozessiert (2 Std.) (4). Diese Ergebnisse stimmen mit der relativen Transportrate von K^b und D^b in RMA-S-Zellen überein. Die IFN-γ-Behandlung steigert die Synthese der schweren Ketten, so dass mehr K^b- und D^b-Moleküle zur Zelloberfläche von RMA- und RMA-S-Zellen transportiert werden. Die Transportrate von K^b- und D^b-Molekülen wurde nicht von der IFN-γ-Behandlung in RMA- und RMA-S-Zellen beeinträchtigt. Keine K^b-Moleküle wurden dagegen in CMT.64-Zellen mit dem 142.23.3-mAK erfasst.
BEISPIEL 4
Intrazellulärer Transport von freien und zusammengebauten Formen von K^b- Molekülen in nicht induzierten und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen
Wie vorstehend erläutert kann der 142.23.3-mAK die nicht zusammengebauten und peptidfreien schweren Ketten der K^b-Moleküle nicht erkennen (4). Dieser Angelegenheit wird nachgegangen, indem ein Kaninchenanti-Exon-8-Serum, das gegen ein konformationsunabhängiges Epitop gerichtet ist, das ein Peptid im cytoplasmatischen Schwanz der H-2K^b-Moleküle erkennt (Williams, D. et al., 1989, J. Immunol. 142: 2796) zur Erfassung und Verfolgung der Prozessierung der K^b-Moleküle in nicht induziertem oder IFN-γ-induzierten CMT.54-Zellen verwendet wurde.
Die Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin markiert und in einem Überschuss von kaltem Methionin für die in Std. angegebenen Zeiten im Oberteil von 5 gechased. Löslich gemachte Antigene wurden mit einem Kaninchen-Anti-Exon-8-von H-2K^b-Serum immungefällt, das den cytoplasmatischen Schwanz von freien und zusammengebauten K^b-schweren Ketten wie hier beschrieben erkennt. Die Behandlungen sind wie oben angegeben, und die Wanderung des Molekulargewichtsmarkers ist auf der linken Seite von 5 angegeben. Radioaktive Proteine wurden nach 4 Tagen Exposition gegenüber RPN-30-Film (Amersham, Corp.) erfasst.
In nicht induzierten CMT.64-Zellen wurden K^b-Moleküle früh nach der Synthese erfasst (5, 0h, 0,5h und 1 h Chase-Zeit), sie waren jedoch instabil und zum Großteil nach 8 Std. Chase abgebaut, wobei sehr wenig Moleküle zu einem höheren Molekulargewicht prozessiert wurden (5, 8 h. Chase-Dauer) prozessiert. In induzierten Zellen wurden K^b-Moleküle in höheren Mengen synthetisiert, und es wurde ein größerer Anteil der Moleküle zu einem höheren Molekulargewicht prozessiert (5). Die Abnahme der Materialmenge, die durch dieses Antiserum immungefällt wird, während des Chases konnte nicht erklärt werden. Ein Verlust oder ein Abbau des Epitops, das durch das Antiserum erkannt wird, während des Transports, ist möglich. Zudem werden D^b-Moleküle ebenfalls synthetisiert und werden dann abgebaut oder denaturiert (4). Bei nicht induzierten CMT.64-Zellen wurden keine prozessierten D^b-Moleküle erfasst, selbst nach 4 Std. Chase. Nur die Behandlung mit IFN-γ führt zu einer höheren Expression, gesteigertem Transport und einer gesteigerten Transportrate von K^b- und D^b-Molekülen in CMT.64-Zellen. Somit wurden Komponenten, die für den Zusammenbau und den Transport von K^b-schwere Ketten und β₂m nötig sind, durch IFN-γ in CMT.64-Zellen induziert, wohingegen eine ähnliche Induktion den Transport von D^b und K^b in RMA- oder RMA-S-Zellen nicht signifikant veränderte. Dies zeigt, dass CMT.64-Zellen wahrscheinlich in Komponenten defizient sind, die für den MHC-Klasse-I-Zusammenbau nötig sind, welches sich von dem TAP-Defekt in RMA-S-Zellen unterscheidet.
BEISPIEL 5
VSV-N 52-59 Peptid-Reaktion bei der CTL-Erkennung
Zur Untersuchung der Funktion der MHC-Klasse-I-Moleküle wurde die CTL-Erkennung von CMT.64-Zellen, die IFN-γ-induziert oder nicht induziert waren, und von RMA-S-Zellen, die mit exogenen Peptiden behandelt waren, untersucht. CMT.64-Zellen (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) und RMA-S-Zellen (RMA-S) wurden mit Peptid N52-59 bei den in 6 angegebenen Konzentrationen behandelt. Die durch spezifische CTL-Erkennung und Lyse freigesetzte Radioaktivität wurde gemessen und dargestellt, wie in den vorstehend beschriebenen Materialien und Methoden angegeben. Die in 6 gezeigte freigesetzte Radioaktivität ist der Durchschnitt von vierfachen Vertiefungen. Die spontane Freisetzung lag nicht über 13%.
In einer dosisabhängigen Weise waren die RMA-S- und IFN-γ-behandelten Zellen 10000 mal empfindlicher als CMT.64-Zellen gegenüber dem Abtöten durch spezifische CTL nach 2 Std. Behandlung mit exogenen Peptiden (6). Diese Ergebnisse bieten einen Beweis für die niedrige Expression von Peptid empfangenden MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche von nicht induzierten CMT.64-Zellen. Bei der Dosisantwort von RMA-S-Zellen wurde ein Maximum von 15000 Peptidmolekülen pro Zelle benötigt, um ein 50%iges Abtöten durch spezifische CTL zu erzielen, wohingegen eine niedrigere Schwelle von 150 Molekülen pro Zelle zur Freisetzung von 5 bis 10% ⁵¹Cr führte. Diese Daten können durch eine hohe Menge empfangender Moleküle oder eine hohe Affinität der MHC-Klasse-I-Moleküle für das Peptid auf der Oberfläche von RMA-S- und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen erklärt werden. Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Assays, wobei es keine exogenen β₂m gibt, stabilisieren die exogen zugegebenen Peptide wahrscheinlich die leeren K^b-Moleküle, die an der Zelloberfläche der RMA-S ankommen, bevor sie aus β₂m dissoziieren (Rock, K. et al., 1991, Cell 65: 611 und Jefferies W. et al., siehe oben, 1993). Die niedrige Menge des leeren K^b, das in uninduzierten CMT.64-Zellen transportiert wird, erläutert den Unterschied der Sensibilisierung gegenüber exogenen Peptiden.
BEISPIEL 6
Expression von TAP-1- und TAP-2-Genen in CMT.64- und RMA-S-Zellen
Die in den 2 bis 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass trotz seiner niedrigen Expression β₂m allein nicht für das Fehlen der Antigenpräsentation in CMT.64-Zellen verantwortlich ist. Zudem werden die K^b- und D^b-Moleküle in diesen Zellen synthetisiert, jedoch werden sehr wenige zur Zelloberfläche transportiert, wo sie exogen zugefügte Peptide binden. Neben den schweren und leichten Ketten sind Peptide für einen effizienten Zusammenbau der MHC-Klasse-I-Moleküle im ER notwendig (Spies, T. et al., 1990, Nature 348: 744; Monaco, J.J. et al., 1990, Science 250: 1723; Spies, T. und DeMars, R., 1991, Nature 351: 323 und; Townsend, A. et al., 1989, Nature 340: 443). Die Möglichkeit, dass das Fehlen der Komponenten, die für die Erzeugung und den Transport dieser Peptide im ER verantwortlich sind, für den CMT.64-Phänotyp verantwortlich ist, wurde untersucht.
Ein putativer Peptidtransporter, der mutmaßlich aus einem Heterodimer von zwei halben Transportern des ABC-Typs, den sogenannten TAP-1 und TAP-2, besteht, wurde bei der Translokation der Peptide in das ER für den MHC-Klasse-I-Zusammenbau in Zusammenhang gebracht (Kelly, A. et al., 1992, Nature 355: 641 und Powis, S.H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1463). Zur Charakterisierung des Unterschieds der Phänotypen zwischen RMA-S- und CMT.64-Zellen wurde die Expression von TAP-1- und TAP-2-Genen in diesen Zellen durch Northern-Blot-Analyse der Gesamt-Zell-RNA aus RMA-, RMA-S-, CMT.64-Zellen, die IFN-γ-induziert und nicht induziert waren (7), untersucht. 10 μg Cytoplasma-RNA aus CMT.64-, RMA- und RMA-S-Zellen, IFN-γ- induziert (+) oder nicht induziert (–), wurden analysiert, und die Ergebnisse sind in der 7 gezeigt. TAP-1-, TAP-2- und β-Aktin-Sonden wurden mit der Membran hybridisiert. Die an spezifische RNA-Sequenzen gebundene Radioaktivität wurde nach Exposition der Membran über Nacht gegenüber einem XAR-Film erfasst.
In 7 zeigt die Northern-Blot-Analyse, dass nicht induzierte CMT.64-Zellen keine erfassbare Menge an TAP-1- und TAP-2-mRNA exprimierte, und dass die Menge dieser mRNAs nach der IFN-γ-Behandlung dieser Zellen stark erhöht war. Zudem zeigt die 7, dass kein größerer Unterschied zwischen TAP-1- und TAP-2-Genexpression in RMA-S- und RMA-Zellen bestand, und dass die IFN-γ-Behandlung nur marginal die TAP-1- und -2-Expression in diesen Zellen beeinflusste. Die Menge der Aktin-mRNA gibt ein Anzeichen der nahezu gleichen Menge mRNA, die auf das Gel zum Northern-Blotting aufgetragen ist. Die IFN-γ-Induzierbarkeit von TAP-1 und -2 wurde zuvor in Mausgeweben aufgezeigt (Gaskin, H.R. et al., 1992, Science 256: 1826), jedoch wurde dies nicht in RMA-, RMA-S- oder CMT.64-Zellen vor dieser Studie untersucht. Die hier aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die TAP-1- und TAP-2-Gene in CMT.64-Zellen mit IFN-γ induzierbar sind und zu einem geringerem Maße in RMA- und RMA-S-Zellen. Das Fehlen der TAP-1- und TAP-2-mRNA-Expression in CMT.64-Zellen verursacht wahrscheinlich ein Fehlen der Antigenpeptide im ER für die Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle und deren Zusammenbau. Dies führt zu einer Nicht-Erkennung der VSV-infizierten CMT.64-Zellen. RMA-S-Zellen exprimieren dagegen ein funktionelles TAP-1-Molekül, das Peptide bei der Durchquerung der ER-Membran unterstützen kann. Dies würde den Zusammenbau und den Transport der MHC-Klasse-I in RMA-S-Zellen und ihre CTL-Erkennung nach der VSV-Infektion erklären. Das Fehlen von TAP-1 und TAP-2 in nicht induzierten CMT.64-Zellen kann einer der Faktoren sein, die für den Phänotyp der CMT.64-Zellen verantwortlich ist, der durch die Bildung instabiler und ineffizient transportierter MHC-Klasse-I-Komplexe gekennzeichnet ist.
BEISPIEL 7
Proteasomen-Komponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen die mit IFN-γ induziert waren oder nicht
Vor dem Schluss, dass die TAP-Defizienzen die wahrscheinlichen oder einzigen Defekte in CMT.64-Zellen sind, wurde das Vorhandensein von Proteasomen-Komponenten in diesen Zellen untersucht. Virale Peptide werden wahrscheinlich im Cytoplasma durch das Proteasom erzeugt (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991; Brown, M.G., et al., Nature 353: 355, 1991; Glynne, R. et al., Nature 353: 357, 1991; Martinez, C.K. und J.J. Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly A. et al., Nature 353: 667, 1991: Yang Y. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 4928, 1992; und Goldberg, A.L. und K.L. Rock, Nature 357: 375, 1992) vor dem Durchqueren der ER-Membran. Die Proteasomen-Komponenten sind wahrscheinlich Schlüsselverbindungen bei der Antigenprozessierung, die in diesen Zellen fehlen könnte. Ein Kaninchen-anti-Ratte-Proteasom-Serum wurde verwendet, das das Maus-Proteasom erkennt. Nach der Immunfällung der Proteasomen können die verschiedenen niedermolekularen Komponent-Polypeptide (LMP), die in diesen Mauszellen produziert werden, durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert werden.
Zweidimensionale Gelanalyse der Proteasomenkomponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ induziert oder nicht induziert waren, sind in der 8 gezeigt. Die Zellen wurden für 2 Std. mit ³⁵S-Methionin markiert. Solubilisierte Antigene wurden mit einem Kaninchen-anti-Ratte-Proteasom-Serum immungefällt und nach dem isoelektrischen Focussieren in einer ersten Dimension und 10–15% SDS-PAGE in einer zweiten Dimension analysiert. Die radioaktiven Proteine wurden nach 10 Tagen Exposition gegenüber einem XAR-Film erfasst. Die Behandlung der Zellen ist oben in 8 angegeben. Die saure Seite des Gels ist auf der rechten Seite und die basische Seite ist auf der linken Seite des Gels. Die Wanderung der Molekulargewichtmarker ist auf der linken Seite des Gels angegeben. Die fehlenden Proteine sind durch einen Pfeil angezeigt und nummeriert (8). Die Proteine mit den Nummern 1 und 7 entsprechen LMP-7 bzw. LMP-2.
Die zweidimensionale Gelanalyse der Immunfällungen ergab, dass die Hauptkomponenten der Proteasomen nicht durch eine IFN-γ-Behandlung von CMT.64-Zellen beeinträchtigt werden, aber dass sieben Komponenten, wie u.a. LMP-2 und -7 in nicht induzierten CMT.64-Zellen fehlten. Gemäß den Ergebnissen anderer Gruppen (Früh, K. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 22131) entsprechen die Proteine mit den Nummern 1 und 7 in 8 LMP-7 bzw. LMP-2. LMP-2, LMP-7 und fünf andere Komponenten des Proteasoms wurden durch IFN-γ in RMA- und RMA-S-Zellen leicht hochreguliert, und induzierten von einem Zustand einer nicht erfassbaren Expression auf eine stärker erfassbare Menge der Expression in IFN-γ-behandelten CMT.64-Zellen (8). LMP-7 (8, 1) wird in CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, besonders stark induziert. Diese Ergebnisse stehen den Ergebnissen anderer Gruppen entgegen, die nahe legten, dass CMT.64 einen niedrigen Spiegel sämtlicher Proteasomen-Komponenten exprimieren (Ortiz-Navarette, V. et al., 1991, Nature 353: 662), und diese neuen Ergebnisse zeigen, dass diese induzierten Proteasomenkomponenten die Aktivität des Proteasoms beeinträchtigen und die Erzeug der VSV-N-Peptide in induzierten CMT.64-Zellen ermöglichen. Neuere Daten (Arnold, D. et al., 1992, Nature: 171, und Momburg, F. et al., 1992, Nature 360: 174) legen nahe, dass LMP-2 und -7 für eine Influenza-Virus-Antigenpräsentation in Zellmutanten, die mit den TAP-1- und TAP-2-Genen transfiziert wurden, nicht nötig sind.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass IFN-γ-Behandlung zusätzlich zur Induktion der Transkription von TAP-1- und TAP-2-Genen auch die Synthese von sieben Komponenten der Proteasomen hochreguliert, einschließlich LMP-2 und -7 Andere beschreiben, dass Komponenten neben LMP-2 und LMP-7 in HeLa-Zell-Proteasomen durch IFN-γ-Behandlung hochreguliert werden (Yang, Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4928, 1992; und Früh, K. et al., J. Biol. Chem. 267: 22131, 1992). Da diese Zellen jedoch funktionell Wildtyp sind, wurde der funktionellen Konsequenz dieser Regulation nicht nachgegangen. Da LMP-2 und LMP-7 darüber hinaus zuerst als Vorstufenproteine synthetisiert werden, die zu kleineren Produkten gespalten werden (Früh, K. et al., J. Biol. Chem. 267: 22131, 1992), können einige der 5 zusätzlichen Proteine, die bei uninduzierten CMT.64-Zellen fehlen, die Vorstufenproteine von LMP-2 und LMP-7 sein.
BEISPIEL 8
Erkennung von VSV-infizierten TAP-1-positiven CMT.64-Zellen
Die Erwägung der angereicherten Daten, bezüglich der Antigenprozessierung in RMA-S- und CMT.64-Zellen führt zu der Behauptung, dass ein funktionelles TAP-1-Protein-Homodimer allein den Transport des VSV-N 52-59 Peptids aus dem Cytosol in das ER-Lumen erleichtert, wo die Bindung an die schwere Ketten erfolgt. Eine alternative Erklärung ist, dass dieses Peptid keinen Transporter für die Translokation über die ER-Membran benötigt, jedoch nicht in den CMT.64-Zellen erzeugt wird. Zur eindeutigeren Definition des Defekts, der die Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen durch spezifische CTL beeinflusst, wurde das Ratten-Tap-1-Gen in die CMT-64-Zellen eingebracht.
CMT.64 (CMT), CMT.64, das mit TAP-1 transfiziert wurde (CMT TAP 1) und CMT.64-Zellen, die nur mit dem Vektor (CMT Vec) transfiziert wurden, wurden mit oder ohne VSV für 8 Std. bei einer MOI von 5 infiziert, oder mit N52-59-Peptid für 2 Std. bei 500 pM (50% Dosisantowrt) behandelt. Die spontane Freisetzung überschritt 12% nicht. Die 9 zeigt, dass VSV-Infizierte TAP-1-positive CMT.64-Zellen durch spezifische CTL erkannt wurden. Dieses Ergebnis erläutert den RMA-S-Phänotyp und seine offensichtliche "Undichtigkeit" in Bezug auf die VSV-Präsentation (Esquivel, F. et al., J. Exp. Med. 175: 163, 1992; Hosken, N.A. und M.J. Bevan, J. Exp. Med. 175: 719, 1992). TAP-1 allein schien zur VSV-Präsentation in RMA-S-Zellen und in transfizierten CMT.64-Zellen auszureichen, und sie können ein Homodimer bilden, das die Translokation spezifischer Peptide in das Lumen des ER bewirken kann. Neben den Transportern kann der Unterschied im RMA-S- und CMT.64-Phänotyp auf einem Niveau erklärt werden durch die größere Menge viraler Peptide, die in den RMA-S-Zellen erzeugt wird. Es scheint interessanterweise, dass eine totale Repression der Expression beider LMPs und TAPs, die sich in dem gleichen Bereich der Klasse II befinden, hineichen, dass jegliche Expression der Klasse I auf der Zelloberfläche vermieden wird. Dies kann für einige Krebszellen sehr wichtig sein (Brodsky, F.M. et al., Eur. J. Immunol. 9: 536, 1979; Restifo, N.P. et al., J. Exp. Med. 177: 265, 1993 und Bikoff, E.K. et al., Eur. J. Immunol. 21: 1997, 1991), indem ein Verfahren bereitgestellt wird, durch das Tumorzellen der Immunüberwachung entgehen.
BEISPIEL 9
TAP-Genexpressions-Profile von CMT.64 und CMT.64/R1-4
Zur Untersuchung der Fähigkeit von TAP-1 zur unabhängigen Funktion beim Peptidtransport, wurde die Ratten-TAP-1-cDNA in die Kleinzelllungenkarzinomzelllinie CMT.64 aus Maus, die keine endogene TAP-1- oder TAP-2-mRNA exprimiert, eingebracht (10). Die endogenen TAP-Gene, sowie diejenigen, die die mutmaßlichen Proteasomen-Komponenten LMP2 und 7 codieren, werden nur nach IFN-γ-Behandlung exprimiert (10). Die positiven Transfektanten wurden mittels Neophosphotransferase-Selektionssystem selektiert, und die konstitutive Expression des TAP-1-Gens durch Northern-Blotting bestätigt.
Insbesondere die Transfektion von CMT.64-Zellen mit Ratten-cDNA-TAP-1 (in dem pHb Apr-1-Neo-Expressionsvektor wie in Powis, S.J. et al., Nature 354, 528–531 (1991) beschrieben), wurde durch Lipofektion (Lipofectin, BRL) erzielt, wobei 10 μg DNA verwendet wurden. Die Selektion erfolgte in 1 mg/ml G418 (Gibco). Die Gesamt-RNA wurde mit Guanidinisothiocyanat isoliert und auf einem 1 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, das 2,2 M Formaldehyd enthielt (10 μg/Spur). Das Blotting und die Hybridisierung mit [³²P]-markierten cDNAs (TAP-1 und 2) oder Oligonukleotid (Aktin) wurde wie hier beschrieben durchgeführt.
Sowohl TAP-1- als auch -2-mRNA-Transkripte fehlten in nicht-induzierten CMT.64-Zellen, wurden aber in CMT.64-Zellen erfasst, die in der Gegenwart von 200 Units/ml Maus-rekombinantem IFN-γ für 48 Std. gezüchtet wurden (10). CMT64/r1-4 exprimierte hohe Mengen vektorstämmiger TAP-1-mRNA, blieb jedoch für TAP-2 negativ. Aktin-mRNA wurde zur Demonstration verwendet, dass gleiche Mengen RNA aufgetragen wurden.
Drei stark exprimierende Klone wurden für anschließende Experimente ausgewählt (10). Drei Klone, die nur mit dem Vektor transfiziert wurden, wurden ebenfalls selektiert und als Kontrollen in den anschließenden Experimenten verwendet.
BEISPIEL 10
TAP-1-Expression reicht zur Erhöhung der Menpen K^b und D^b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen aus
CMT.64-Zellen exprimieren fast keine Oberflächen-MHC-Klasse-I-Moleküle, trotz der Synthese von D^b- und K^b-schwere Ketten (Jefferies, W.A. et al., siehe oben, 1993). Zur Bestimmung des Einflusses von TAP-1 auf die Oberflächen-Klasse I-Expression, erfolgte eine Durchflusscytometrie mit Antikörpern gegen D^b und K^b. Insbesondere die Zellen wurden mit oder ohne Primärantikörper für 1 Std. inkubiert. Alle Inkubationen wurden bei 4°C durchgeführt. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Ig-Antikörper (20 mg/ml) für eine weitere Std. inkubiert. Nach zwei Runden Waschen wurden die Zellen in 1,5% Paraformaldehyd fixiert. Die fluoreszierenden Profile wurden erhalten durch Analyse von 5000 Zellen in einem halblogarithmischen Schema mit dem FACScan^®-Programm.
Die Durchflusscytometrie-Analyse zeigte, dass die TAP-1-Expression zur Steigerung der Mengen von K^b und D^b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen, wie in der 11 gezeigt, ausreichte. Die Antikörper 28.14.8s und Y-3 erkennen D^b bzw. K^b. In allen Feldern sind die mit dem angegebenen Primärantikörper erhaltenen Ergebnisse durch eine durchgezogene Linie gezeigt. Die gepunktete Linie veranschaulicht die Werte, die in der Abwesenheit eines Primärantikörpers erhalten werden. Die gezeigten Ergebnisse veranschaulichen drei unabhängige Experimente.
Für beide untersuchten Antikörper bestand ein erfassbarer Anstieg der Oberflächenexpression in den CMT-TAP-1-Transfektanten, verglichen mit CMT-64 und den Vektorkontrollen, was nahe legt, dass TAP-1 allein die Peptide zur Stelle des MHC-Zusammenbaus brachte, so dass stabile Komplexe entstehen konnten, die zur Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert werden konnten. Die Menge des Transferrin-Rezeptors, der an der Zelloberfläche exprimiert wurde, blieb durch die Transfektion von TAP-1 unverändert, was zeigt, dass dies keine allgemeine Wirkung auf die Plasmamembranproteine hatte (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu anderen Systemen, wo es nicht möglich war, die Beteiligung eines alternativen Mechanismus des Peptidtransports unberücksichtigt zu lassen (Hosken, N.A. & Bevan, M. J. J. Exp. Med. 175: 719–729 1992; Esquivel, F., Yewdell, J & Bennink, J. J. Exp. Med. 175: 163–168, 1992; Zweerink, H.J. et al., J. Immunol. 150: 1763–1771, 1993), zeigen diese Ergebnisse eindeutig die Fähigkeit von TAP-1 zur Steigerung der Oberflächen-Klasse-I-Expression bei Fehlen von TAP-2 in CMT-64-Zellen.
BEISPIEL 11
Pulse-Chase-Analyse von K^b- und D^b-Molekülen aus CMT.64- und TAP-1-transfizierten CMT-64-Zellen
Der intrazellulärer Transport von Klasse-I-schwerer Kette zur Zelloberfläche ist von der Prozessierung zu einer höhermolekularen Form begleitet durch Modifikation des N-verknüpften Glycans während der aufeinander folgenden Exposition gegenüber Golgi-spezifischen Enzymen. Es wurden daher Pulse-Chase-Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine solche Prozessierung in den CMT-TAP-1-Transfektanten erzielt wurde, wie es durch den Anstieg der Oberflächenexpression von K^b und D^b vorhergesagt wird.
Pulse-Chase und Immunfällung von K^b und D^b erfolgten mit einem 15-Minuten-Puls mit ³⁵S-Methionin (Amersham) und monoklonalen immungefällten 28.14.8s (anti-D^b) und Y-3 (anti-K^b)-Antikörpern nach den vorstehend beschriebenen Verfahren. Die Proben wurden mit SDS-PAGE auf 10–15%igen Gelen analysiert und mit einer Amplifikationslösung behandelt. Das Autoradiogramm wurde nach 10 Tagen entwickelt.
Der Transport von K^b- und D^b-Molekülen zur Zelloberfläche erfolgte in den TAP-1-transfizierten Zellen, wie es durch den Anstieg des Molekulargewichts der schweren Kette während der Oligosaccharid-Seitenketten-Prozessierung (12) angezeigt wird. Bei nicht transfizierten CMT.64-Zellen wurde keine Prozessierung beobachtet (12), was die Zurückhaltung innerhalb des endoplasmatischen Reticulums oder cis-Golgi anzeigt. Dies wurde durch die Empfindlichkeit gegenüber Endoglycosidase H bestätigt (Daten nicht gezeigt).
Zusammengefasst ergab der Vergleich zwischen CMT.64 und CMT64/r1-4, dass die Anwesenheit von TAP-1- die Prozessierung von D^b und K^b ermöglichte (12). Zudem wurde durch Endoglycosidase H-Behandlung bestätigt, dass die höhermolekularen prozessierten Formen von K^b und D^b resistent gegenüber Spaltung waren (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse bestätigen weiter die Bedeutung von TAP-1 für den Transport und die Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen in diesen Zellen.
BEISPIEL 12
TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen präsentieren effizient Antigen an VSV-spezifische CTL
In vorhergehenden Untersuchungen wurde festgelegt, dass CMT.64-Zellen keine VSV-Peptide an cytolytische T-Lymphozyten (CTL) präsentieren konnten, wenn sie nicht mit IFN-γ vorbehandelt waren, oder direkt mit einem synthetischen Peptid inkubiert waren, das von dem VSV-N-Protein hergeleitet wurde (Jefferies, et al., J. Immunol. 151: 2974–2985, 1993). Zur Untersuchung der Fähigkeit der TAP-1-Expression zur Komplementierung der funktionellen Antigen-Prozessierung und Präsentation wurden Chrom-Freisetzungstests mit VSV-spezifischen CTL mittels CMT.64 und CMT-TAP-1- und CMT-Vektortransfektanten als Ziele durchgeführt.
Insbesondere wurden CMT.64-Zellen (CMT) und CMT-TAP-1-Transfektanten mit VSV (MOI: 2) für 8 bis 10 Std. infiziert, oder mit dem Influenza-Stamm A/PR/8/34 für 48 Std. (bei 300 HA-Einheiten für RMA, und 500 HA-Einheiten für CMT.64 und ihren Derivate) behandelt. Effektor-CTL-Populationen wurden durch Infektion von C57bl/6-Mäusen mit VSV in den Pfotenballen und Ohren oder 700 HA-Einheiten Influenza i.p. erzeugt. VSV-CTL wurden hergeleitet von abführenden Lymphknoten, wie sie an Tag 5 nach der Immunisierung gesammelt wurden, und Einzelzellsuspensionen wurden bei 4 × 10⁶ Zellen pro ml für 3 Tage in Abwesenheit jeglicher Restimulation gezüchtet. Influenza-CTL wurden 4 bis 5 Wochen nach der Immunisierung von Splenocyten hergeleitet, die in Gegenwart von Influenza-infizierten Stimulatoren für 6 Tage gezüchtet wurden. Das Kulturmedium bestand aus einem 1:1-Verhältnis von RPMI-1640 und NCTC-109, supplementiert mit 10% FBS, L-Glutamin, Pen/Strep, und 2 ME. Ziele und Effektoren wurden gemischt und 4 Std. inkubiert. Scheininfizierte Zellen (+---) wurden als negative Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als % spezifische Freisetzung, wie eingehend beschrieben in Jefferies, W.A. Kolaitis, G. & Gabathuler, R. J. Immunol. 151, 2974–2985 (1993).
Die in der 13 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen (Klone CMT-r1.1, r1-4 und r1-10) gegen VSV-spezifische CTL effizient Antigen präsentieren. Die Einführung von TAP-1 in CMT.64-Zellen stellt die Antigenpräsentation nach der VSV-Infektion wieder her. Wildtyp-CMT.64-Zellen und vektortransfizierte CMT-Zellen, die mit VSV-infiziert sind, werden nicht durch CTL erkannt. 17 zeigt, dass Influenza-Virus nicht an spezifische CTL durch CMT-TAP1-Zellen präsentiert wird. CMT.64-, RMA- und CMTr1.4-Zellen wurden mit Influenza-Virus infiziert und influenzaspezifischen CTL ausgesetzt. In diesem Fall gab es jedoch keine Erkennung der CMT-TAP-1-Zellen. Beide positiven Kontrollen, RMA und CMT.64 + Inf, wurden effizient durch CTL lysiert.
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, welche zeigen, dass die VSV-Expression nur die Expression des TAP-1-Transporters erfordert, und dass die Erkennung von CMT.64-Zellen, die das Ratten-TAP-1-allein exprimierten, fast so effizient ist, wie Zellen, die beide Transporter TAP-1 und TAP-2 exprimieren. Die Expression von nur TAP-2 schien nicht so effizient zu sein (14). Verschiedene Ratten-TAP-1-Klone wurden ebenfalls analysiert und bestätigten die vorhergehenden Schlussfolgerungen (15).
Influenza-Virus-infizierte Zellen werden nur bei Vorhandensein beider Ratten-TAP-Gene effizient erkannt (16 bis 18). Die 16 zeigt, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach der Influenza-Infektion erkannt werden. CMT.64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, werden nicht erkannt. Die 17 zeigt die gleichen Ergebnisse, die in einem zweiten unabhängigen Experiment beobachtet werden. Die 18 zeigt zudem, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, CMT.64-Zellen, die mit beiden Ratten-TAP-Genen behandelt wurden, nach der Influenza-Virusinfektion erkannt werden. 19 zeigt, dass HSV-infizierte Zellen durch spezifische CTL erkannt werden, unabhängig von der Expression des Ratten-TAP-1- und/oder TAP-2-Transportergens.
Diese Ergebnisse beweisen, dass ein einzelnes TAP-1-Transportermolekül die Antigenpräsentationsfähigkeit für eine defiziente Zelle in Abwesenheit von TAP-2 wiederherstellen kann. Dieser Befund stimmt mit der jüngeren Beobachtung überein, dass das TAP-1-Protein mit der MHC-Klasse-I-schweren Kette in Zellen wechselwirkt, die TAP-2 nicht exprimieren (Suh, W-K., et al., Science 264: 1322–1326, 1994). Dies stellt die absolute Anforderung für eine Heterodimerbildung zwischen den beiden mutmaßlichen Transportermolekülen in Frage und zeigt, dass verschiedene Formen des Transporterkomplexes funktionell sind und den Transport verschiedener Untergruppen des Antigenpeptidpools für den Zusammenbau mit MHC-Klasse-I-Molekülen vermitteln.
BEISPIEL 13
Wirkungen von TAP auf das Tumor-Überleben
Mäusen wurden CMT.64-Zellen oder CMT.12.12-Zellen (ein Ratten-TAP-1- und TAP-2-transfizierter Klon) ip bei 2 × 10⁵ und 5 × 10⁵ Zellen pro Maus injiziert. Die Zelllinien wurden vor dem Animpfen in die Empfänger-Maus in PBS resuspendiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Eine der Mäuse, die mit 5 × 10⁵ CMT.64-Zellen behandelt wurde, wurde getötet und eine Autopsie ergab klar das Vorhandensein eines soliden Tumors an der Injektionsstelle. Zudem waren sämtliche mesenterischen Lymphknoten stark vergrößert.
BEISPIEL 14
Es folgt ein experimenteller Ansatz zum Auffinden der Peptide, die im ER durch TAP-1-Transporter, TAP-2-Transporter und TAP-1-TAP-2--Transporter transloziert werden.

1. Verwendung von Zelllinien, die TAP-1, TAP-2 und TAP-1 TAP-2-Transporter exprimieren; beispielsweise CMT.64-Zellen, die mit cDNA aus TAP-1 und TAP-2, CMT.64, CMT.1-4, CMT.2-10, CMT.12-12 transfiziert sind.
2. Subzelluläre Fraktionierung dieser Zellen.
3. Isolation des ER (endoplasmatischen Reticulums)
4. Extraktion der Peptide aus dem ER in 0,1 % TFA.
5. Gelfiltration.
6. Reverse-Phasen-HPLC.
7. Die Fraktionen können gesammelt und auf CTL-Sensibilisierung oder auf Radioaktivität untersucht werden, wenn die Zellen markiert wurden.
8. Schließlich Aminosäure-Sequenzierung.

Vergleich des HPLC-Profils aus verschiedenen Zelllinien, die verschiedene TAP-Transporter exprimieren, bieten eine Information über die Peptid-Transportabhängigkeit von TAP-Molekülen. Peptid-Peaks können isoliert und analysiert werden. Die Sequenzierung der Peptide bietet Information über das Motiv, das für den Transport mit TAP-1 allein, TAP-2 allein oder TAP-1- und TAP-2-Molekülen notwendig ist. Das Protokoll für die Peptidanalyse und Sequenzierung ist Standard und beschrieben in den Veröffentlichungen von Rammensee und von Engelhard.
BEISPIEL 16
Antisense-Knockout in RMA-S-Zellen
Dieses vorläufige Experiment erfolgte auf im Großmaßstab selektierten Populationen der Zellen. Das verwendete Konstrukt war das gleiche pHβA-neo, mit dem sämtliche MTP 1- und -2-Klone wie vorstehend beschrieben erhalten wurden. In dieser Untersuchung wurde das MTP1-cDNA-Insert ausgeschnitten und durch eine Sequenz in der entgegengesetzten Richtung ersetzt. RMS-Zellen haben nur TAP-1, nicht TAP-2, so dass nur MTP-1-antisense verwendet wurde. Die nachstehenden Daten stammen aus einer Einfarben-FACS-Analyse, die Zahlen sind linear (5000 Ereignisse gezählt/Probe). Der 28.14.8s-Antikörper ist spezifische für Db, und der Y-3-Antikörper ist spezifisch für K^b. Das Antisense-Konstrukt wird als RMA-S.ptml bezeichnet.
BEISPIEL 17
Wirkung von TAP-1 und TAP-2 auf das Überleben der Mäuse denen Tumorzellen injiziert wurden
Das Überleben syngener C57bl/6- und allogener Kontroll-Balb/C-Mäuse, denen sehr hohe Dosen CMT.64-Zellen injiziert wurden (aus C57BI/6-Mäusen) oder CMT.12.12-Zellen (CMT-64-Zellen, die mit TAP-1 und TAP-2-Zellen transfiziert wurden) wurde folgendermaßen untersucht.
5 × 10⁵ CMT.64 oder CMT.12.12-Zellen wurden in Mäuse intraperitoneal injiziert und die Mäuse wurden 90 Tage überwacht. Die Mäuse wurden nach dem Tod oder nach 90 Tagen einer Autopsie unterworfen. Das Überleben der Mäuse ist in der 20 gezeigt. Die Ergebnisse der Autopsien sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. All den syngenen C57BL/6-Mäusen, denen CMT-64-Zellen injiziert wurden, waren vor 60 Tagen tot. Es stellte sich heraus, dass diese Mäuse invasive generalisierte metastasierte Tumore im ganzen Körper hatten, und sie aufgebrochene Organe und/oder perforierte Därme mit übermäßiger Flüssigkeit in der Peritonealhöhle aufwiesen. Dies wurde als Typ-B-Pathologie klassifiziert. Etwa 20% der syngenen Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, waren nach 60 Tagen noch am Leben, und 3 der 20 waren nach 90 Tagen noch am Leben. 17 dieser Mäuse von insgesamt 20 hatten eine Typ-B-Pathologie, 2 hatten keine offensichtliche Pathologie und eine hatte die nachstehend beschriebene Typ-A-Pathologie.
Etwa 70% der allogenen Kontrollmäuse, denen CMT.64-Zellen injiziert wurden, waren nach 90 Tagen noch am Leben, und wiesen keine signifikante Pathologie auf. Die wenigen Ratten, die eine Pathologie aufwiesen, hatten nur kleine Tumore (4 bis 15 mm) an der Injektionsstelle. Dies wurde als Typ-A-Pathologie klassifiziert. 100% der allogenen Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, waren nach 90 Tagen am Leben, und zeigten keine Pathologie.
Die Ergebnisse zeigen, dass syngene Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, länger überlebten, als diejenigen, die mit CMT.64-Zellen transfiziert wurden, möglicherweise aufgrund der verbesserten MHC-Klasse I-Antigen-Präsentation und Erkennung durch das Wirts-Immunsystem. Die syngenen Mäuse, die mit CMT.12.12 transfiziert wurden, und die nach 90 Tagen überlebten, zeigten keine oder nur geringfügige Pathologie. TABELLE 1
TABELLE 2
TABELLE 3

Claims

Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sequenz umfasst, die TAP-1 kodiert, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Immunantwort eines Säugetiers erhöht auf eine Tumorzelle, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-1-Moleküle exprimiert, die T-Zellrezeptor-interaktive Antigene tragen und geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, wobei die medizinische Zusammensetzung geeignet ist zur Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz enthält, in die Tumorzelle unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors und zur Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, so dass das Prozessieren und die Präsentation von MHC-Klasse-1-Molekülen, die T-Zellrezeptor-Interaktive Antigene tragen, erhöht wird und die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die medizinische Zusammensetzung Vaccinia-Virus enthält.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Immunantwort eine cytolytische T-Lymphozyten-Antwort ist.