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Patents

  1. Advanced Patent Search
Publication numberDE69534702 T2
Publication typeGrant
Application numberDE1995634702
PCT numberPCT/CA1995/000544
Publication date24 Aug 2006
Filing date22 Sep 1995
Priority date23 Sep 1994
Also published asDE69534702D1, EP0783573A1, EP0783573B1, US6361770, US7378087, US7994146, US20030082195, US20100080776, US20120135031, WO1996009380A1
Publication number1995634702, 95634702, DE 69534702 T2, DE 69534702T2, DE-T2-69534702, DE1995634702, DE69534702 T2, DE69534702T2, DE95634702, PCT/1995/544, PCT/CA/1995/000544, PCT/CA/1995/00544, PCT/CA/95/000544, PCT/CA/95/00544, PCT/CA1995/000544, PCT/CA1995/00544, PCT/CA1995000544, PCT/CA199500544, PCT/CA95/000544, PCT/CA95/00544, PCT/CA95000544, PCT/CA9500544
InventorsReinhard Gabathuler, A. Wilfred JEFFERIES, Gerassimos Kolaitis, S. Gregor REID
ApplicantThe University Of British Columbia, Vancouver
Export CitationBiBTeX, EndNote, RefMan
External Links: DPMA, Espacenet
Verfahren zur erhöhung der expression von endogenen peptiden tragenden mhc klasse i molekulen Process for the increase in the expression of endogenous peptides bearing mhc class i molecules translated from German
DE 69534702 T2
Abstract  available in
Claims(3)  translated from German
  1. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine Sequenz umfasst, die TAP-1 kodiert, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Immunantwort eines Säugetiers erhöht auf eine Tumorzelle, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-1-Moleküle exprimiert, die T-Zellrezeptor-interaktive Antigene tragen und geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, wobei die medizinische Zusammensetzung geeignet ist zur Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz enthält, in die Tumorzelle unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors und zur Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, so dass das Prozessieren und die Präsentation von MHC-Klasse-1-Molekülen, die T-Zellrezeptor-Interaktive Antigene tragen, erhöht wird und die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt. Use of a nucleic acid molecule comprising a sequence encoding TAP-1 coded, for the manufacture of a medical composition comprising the immune response of a mammal increased to a tumor cell expressing low or non-detectable amounts of MHC class 1 molecules, the T wear cell receptor interactive antigens and expressing low or non-detectable amounts of TAP-1 and TAP-2, wherein the medical composition is suitable for introducing a nucleic acid molecule that contains a TAP-1 coding sequence, into the tumor cell under the control of a suitable promoter and for expressing TAP-1 in the tumor cell under suitable conditions, so that the processing and presentation of MHC class 1 molecules, T cell receptor interactive antigens wear is increased and the detection allowed by the immune response of the mammal ,
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die medizinische Zusammensetzung Vaccinia-Virus enthält. Use according to claim 1, wherein the medical composition contains vaccinia virus.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Immunantwort eine cytolytische T-Lymphozyten-Antwort ist. Use according to claim 1 or 2, wherein the immune response is a cytolytic T lymphocyte response.
Description  translated from German
  • GEBIET DER ERFINDUNG FIELD OF THE INVENTION
  • [0001] [0001]
    Die Erfindung betrifft die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Steigerung der Immunantwort eines Säugetiers auf eine Tumorzelle, die niedrige oder nicht nachweisbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, welche endogene Peptide tragen. The invention relates to the manufacture of a medical composition for enhancing the immune response of a mammal to a tumor cell expressing low or undetectable amounts of MHC class I molecules expressed, which carry endogenous peptides.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG BACKGROUND OF THE INVENTION
  • [0002] [0002]
    Die Antwort der cytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) ist ein Hauptbestandteil des Immunsystems, der bei der Immunüberwachung und Zerstörung infizierter oder maligner Zellen und eindringender Organismen, die auf ihren Oberflächen Fremdantigene exprimieren, aktiv ist. The response of cytotoxic T lymphocytes (CTL) is a key component of the immune system, which is in the immune surveillance and destruction of infected or malignant cells and invading organisms expressing foreign antigens on their surfaces, active. Der Ligand des antigenspezifischen T-Zellrezeptors ist ein Komplex, der aus einem Peptidfragment eines Fremdantigens besteht, das an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden ist. The ligand of the antigen-specific T cell receptor is a complex made up of a peptide fragment of a foreign antigen to molecules of the major histocompatibility complex (MHC) is bound. Cytotoxische T-Lymphozyten erkennen insbesondere ein Peptid, das an MHC-Klasse-I-Moleküle gebunden ist. Cytotoxic T-lymphocytes recognize a particular peptide is bound to MHC class I molecules.
  • [0003] [0003]
    MHC-Klasse-I-Moleküle werden gewöhnlich an der Zelloberfläche als ternäre Komplexe exprimiert, die durch eine schwere Kette mit 46 kD, eine als β 2 -Mikroglobulin (β 2 m) bezeichnete leichte Kette mit 12 kD und ein Peptid gebildet werden, das aus 8 bis 10 Aminosäuren besteht (van Bleek, GM und SG Nathenson, Nature 348, 213, 1990; Zhang, W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 8403, 1992; Matsumura, M. et al., Science 257: 927, 1992; und Latron, F. et al., Science 257: 964, 1992). MHC-class-I-molecules are normally expressed at the cell surface as ternary complexes formed by a heavy chain of 46 kD, one as β 2 -microglobulin (β 2 m) designated light chain of 12 kD and a peptide from 8 to 10 amino acids (van Bleek, GM SG and Nathenson, Nature 348, 213, 1990; Zhang, W. et al, Proc Natl Acad Sci USA 89: 8403, 1992; Matsumura, M. et..... al, Science 257: 927, 1992; and Latron, F. et al, Science. 257: 964, 1992).. Die Bildung des ternären Komplexes beinhaltet wahrscheinlich den Transport von Peptiden, die durch Proteinabbau im Cytoplasma erzeugt werden, in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums (ER) (Nuchtern, JG et al., Nature 339: 223, 1989; Yewdell, JW und JR Bennink, Science 244: 1072, 1989; und Cox, JH et al., Science 247, 715, 1990). The formation of the ternary complex probably contains the transport of peptides generated by protein degradation in the cytoplasm, into the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) (Nuchtern, JG et al, Nature 339: 223, 1989; Yewdell, JW and JR Bennink. , Science 244:. 1072, 1989; and Cox, JH et al, Science 247, 715, 1990). Die Untersuchung der Zelllinien-Mutanten, welche wegen ihrer niedrigen Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen an der Zelloberfläche ausgewählt wurden, hat Einblicke in die molekularen Ereignisse gewährt, die für eine Antigenprozessierung erforderlich sind. The examination of cell lines mutants, which were selected on the cell surface because of their low expression of MHC class I molecules has given insights into the molecular events required for antigen processing a. Diese Untersuchungen ermöglichten die Identifizierung von zwei Genen, die im MHC-Bereich lokalisiert sind und die Proteine der Familie der ATP-Bindungs-Cassetten (ABC) codieren. These studies enabled the identification of two genes located in the MHC region and encoding the proteins of the family of ATP-binding cassette (ABC). Diese als TAP-1 und TAP-2 bezeichneten Gene sind am Transport von Peptiden aus dem Cytoplasma in das Lumen des ER beteiligt (Deverson, EV et al., Nature 348: 738, 1990; Trowsdale, J. et al., Nature 348: 741, 1990; Spies, T. et al., Nature 348; 744, 1990; Monaco, JJ et al., Science 250; 1723, 1990; Spies, T. und R. DeMars; Nature 351: 323, 1991; Bahram, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10094, 1991; Spies, T. et al., Nature 355: 644, 1992; Kelly, A. et al., Nature 355: 641, 1992; Powis, SH et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1463, 1992; und Colonna, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3932, 1992). These genes, referred to as TAP-1 and TAP-2 are in the transport of peptides from the cytoplasm to the lumen of the ER involved (Deverson EV et al, Nature 348:.. 738, 1990; Trowsdale, J. et al, Nature 348 : 741, 1990; Spies, T. et al, Nature 348, 744, 1990; Monaco, JJ et al, Science 250, 1723, 1990; Spies, T. and R. DeMars, Nature 351:.. 323, 1991; Bahram, S. et al, Proc Natl Acad Sci USA 88: 10094, 1991; Spies, T. et al, Nature 355:..... 644, 1992; Kelly, A. et al, Nature 355:. 641. , 1992; Powis, SH et al Proc Natl Acad Sci USA 89:.......... 1463, 1992; and Colonna, M. et al, Proc Natl Acad Sci USA 89: 3932, 1992). Zwei andere Gene, die mit MHC zusammenhängen, LMP-2 und -7 (Monaco, JJ und McDevitt, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79; 3001) sind Komponenten des Proteasoms, eines cytoplasmatischen multikatalytischen Proteasekomplexes, der wahrscheinlich für einige Aspekte des Proteinabbaus für die Antigenprozessierung verantwortlich ist (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991; Brown, MG et al., Nature 353: 355, 1991; Glynne, R. et al., Nature 353: 357, 1991; Martinez, CK und JJ Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly, A. et al., Nature 353: 667, 1991; Yang, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 4928, 1992, Goldberg, AL und KL Rock, Nature 357: 375, 1992). Two other genes associated with MHC, LMP-2 and -7 (Monaco, JJ and McDevitt, 1982, Proc Natl Acad Sci USA 79;.... 3001) are components of the proteasome, a cytoplasmic multi-catalytic protease complex that probably responsible some aspects of protein degradation for antigen processing is (Ortiz-Navarette, V. et al, Nature 353:. 662, 1991; Brown, MG et al, Nature 353:. 355, 1991; Glynne, R. et al, Nature. 353: 357, 1991; Martinez, CK and JJ Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly, A. et al, Nature 353:. 667, 1991; Yang, Y. et al, Proc Natl Acad Sci.... . 89: 4928, 1992, Goldberg, AL and KL rock, Nature 357: 375, 1992).
  • [0004] [0004]
    Die Maus-Lymphomzelllinienmutante RMA-S exprimiert niedrige Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche verglichen mit den Wildtyp-RMA-Zellen (Ljunggren, H.-G. et al., J. Immunol. 142: 2911, 1989; und Townsend, A. et al., Nature 340: 443, 1989). The mouse lymphoma cell line mutant RMA-S expresses low levels of MHC class I molecules on the cell surface compared to the wild type RMA cells (Ljunggren, H.-G., et al, J. Immunol 142:.. 2911, 1989; and Townsend, A. et al, Nature 340:. 443, 1989). Mit Influenza-Virus infizierte RMA-S-Zellen präsentieren Influenza-Peptide im Zusammenhang mit D b -Molekülen ineffizient, und werden durch spezifisches CTL nur schwach erkannt (Townsend A. et al., Nature 340: 443, 1989). With influenza virus infected RMA-S cells influenza peptides presented in the context of D b molecules inefficient, and be specific CTL only weakly detected (Townsend A. et al, Nature 340:. 443, 1989). Die Transfektion mit dem mutmaßlichen Transportergen TAP-2 komplementiert diese Defizienz (Powis, SJ et al., Nature 354: 528; und Attaya, M. et al., Nature 355: 647, 1992). Transfection with the putative transporter gene TAP-2 complements this deficiency (Powis, SJ et al, Nature 354: 528; and Attaya, M. et al, Nature 355:. 647, 1992.). Das endogene TAP-2-Gen der RMA-S-Zellen enthält Befunden zufolge eine Punktmutation, die ein Stop-Translations-Codon einbringt, das ein unvollständiges und defektes TAP-2-Protein hervorbringt (Yang, Y et al., J. Biol. Chem. 267: 11669, 1992). The endogenous TAP-2 gene of RMA-S cells containing According to findings a point mutation which introduces a stop translation codon that produces an incomplete and defective TAP-2 protein (Yang, Y et al., J. Biol . Chem. 267: 11669, 1992). Trotz des defekten TAP-2-Proteins in RMA-S-Zellen, überbrücken antigene Peptide aus vesikulärem Stomatitis-Virus den Defekt und werden durch K b -Moleküle in RMA-S-Zellen spezifischen CTL präsentiert (Esquivel, F. et al., J. Exp. Med. 175: 163, 1992; und Hosken, NA und MJ Bevan, J. Exp. Med. 175: 719, 1992). Despite the defective TAP-2 protein in RMA-S cells, bridge antigenic peptides from vesicular stomatitis virus the defect and K b molecules are in RMA-S cells specific CTL presented (Esquivel, F. et al., J. Exp Med 175:.. 163, 1992; and Hosken, and NA MJ Bevan, J. Exp Med 175: 719, 1992)... Das VSV-Nucleokapsid (N)-Peptid, VSV-N-52-59 ist Befunden zufolge das Hauptpeptid, das durch K b -Moleküle auf VSV-infizierten Zellen präsentiert wird (van Bleek, GM und SG Nathenson, Nature 348: 213, 1990). The VSV-nucleocapsid (N) peptide, VSV-N-52-59 is according to the main findings peptide that is presented by K b molecules on VSV infected cells (van Bleek, GM SG and Nathenson, Nature 348: 213, 1990). Das Vorhandensein des Wildtyp-TAP-1-Proteins in RMA-S-Zellen kann für eine Translokation des VSV-N-52-59-Peptids zum ER-Lumen hinreichend sein (Powis, SJ et al., Nature 354: 528, 1991; Attaya, M. et al., Nature 355: 647, 1992; und Yang et al., J. Biol. Chem. 267: 11669, 1992). The presence of the wild-type TAP-1 protein in RMA-S cells can be sufficient for translocation of VSV-N 52-59 peptide to the ER lumen to be (Powis, SJ et al, Nature 354:. 528 1991 ; Attaya, M. et al, Nature 355:. 647, 1992; and Yang et al, J. Biol Chem 267:... 11669, 1992). Alternativ braucht das VSV-N 52-59-Peptid keinen funktionellen Transporter zum Transport in das Lumen des ER. Alternatively, the VSV-N 52-59 peptide transporter no functional need for transport into the lumen of the ER. Die Expression der minigen-codierten Viruspeptidepitope in T2-Zellen (Zweerink, HJ et al., J. Immunol. 150: 1763, 1993) und In-vitro-Translation und -Translokation mit Mikrosomen aus T2-Zellen (Lévy, F. et al., Cell 67: 265, 1991) unterstützen diese Behauptung. The expression of the minigene-encoded Viruspeptidepitope in T2 cells (Zweerink, HJ et al, J. Immunol. 150:. 1763, 1993) and in vitro translation and translocation with microsomes from T2 cells (Lévy, F. et al, Cell. 67: 265, 1991) support this assertion.
  • [0005] [0005]
    Bei einer gesonderten Klasse von antigenprozessierenden Varianten sind der Zusammenbau und die Oberflächenexpression der MHC-Klasse-I-Moleküle ganz durch IFN-γ induzierbar (Klar, D. und GJ Hämmerling, EMBO J. 8: 475, 1989). In a separate class of antigenprozessierenden variants of assembly and surface expression of MHC class I molecules by IFN-γ are quite inducible (Clear, D. and GJ Hammerling, EMBO J. 8: 475, 1989). Beispielsweise erfolgt in der Kleinzelllungen-Karzinomzelllinie CMT.64 die Erkennung durch Influenzavirus-spezifische CTL nicht, wenn sie nicht durch IFN-γ induziert wird (Sibille, C. et al., Eur. J. Immunol. 22: 433, 1992). For example, occurs in the small cell lung carcinoma cell line CMT.64 recognition by influenza virus specific CTL does not, if it is not induced by IFN-γ (Sibille, C. et al, Eur J. Immunol. 22:.. 433, 1992). Die sehr niedrige Menge sämtlicher Proteasomen-Komponenten, die in nicht-induzierten CMT.64-Zellen vorhanden sind, ist wahrscheinlich für ihren Phänotyp verantwortlich (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991). The very low amount of all proteasome components present in uninduced CMT.64 cells is probably responsible for their phenotype (Ortiz-Navarette, V. et al, Nature 353:. 662, 1991). Exogene Influenza-Peptide können an D b -Moleküle auf CMT.64-Zellen binden und die Erkennung durch influenzaspezifische CTL komplementieren (Sibille, C. et al., Eur. J. Immunol. 22: 433, 1992). Exogenous influenza peptides can bind to Db molecules on CMT.64 cells and complement recognition by influenza specific CTL (Sibille, C. et al, Eur J. Immunol. 22:.. 433, 1992). Es wurde zudem gefunden, dass die exogen zu diesen Zellen zugefügten β 2 m- und die VSV-N-52-59-Peptide die Erkennung durch VSV-spezifische CTL, restringiert auf K b , komplementieren (Jefferies WA et al., 1993, J Immunol. 151: 2974). It has also been found that the exogenously added to these cells and the β 2 m-VSV-N 52-59 peptides recognition by VSV specific CTL restricted to Kb, complement (WA Jefferies et al., 1993, J Immunol. 151: 2974). Die Menge β 2 m und der schweren Ketten, die in diesen Zellen synthetisiert werden, können das Ausmaß der MHC-Klasse-I-Expression auf der Zelloberfläche einschränken (Jefferies et al., siehe oben, 1993). The amount of β 2 m and the heavy chain, which are synthesized in these cells, can the amount of MHC class I expression on the cell surface to limit (Jefferies et al., Supra, 1993). Eine Fehlfunktion der mutmaßlichen Peptid-Transporter und/oder bei der Erzeugung des Peptids kann für den CMT.64-Phänotyp verantwortlich sein, der einen Mechanismus zur Abwärtsregulation der MHC-Klasse-I-Expression repräsentiert, eine Eigenschaft, die vielen Karzinomen gemeinsam ist. A malfunction of the putative peptide transporters and / or in the production of the peptide may be responsible for the CMT.64 phenotype which represents a mechanism for down-regulation of MHC class I expression, a feature common to many carcinomas.
  • [0006] [0006]
    Restifo, NR et al., (J. Exp. Med. 177: 265–272, 1993) untersuchten die Antigen-Prozessierungs-Effizienz von 26 verschiedenen Humantumorlinien mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus (Vac) zur transienten Expression des K d -Moleküls. . Restifo, NR et al, (J. Exp Med 177:.. 265-272, 1993) studied the antigen Prozessierungs efficiency of 26 different human tumor lines using a recombinant vaccinia virus (Vac) for the transient expression of the K d molecule , Drei Zelllinien, alles Kleinzelllungenkarzinome, konnten durchweg keine endogen synthetisierten Proteine zur Präsentation an K d -restringierte Vac-spezifische T-Zellen prozessieren. Three cell lines, all small cell lung carcinoma, consistently could not process endogenously synthesized proteins for presentation to Kd -restricted Vac-specific T cells. Pulse-Chase-Experimente zeigten, dass MHC-Klasse-I-Moleküle nicht durch die Zelllinien aus dem endoplasmatischen Reticulum (ER) zur Zelloberfläche transportiert wurden. Pulse-chase experiments showed that MHC class I molecules rather than by the cell lines from the endoplasmic reticulum (ER) have been transported to the cell surface. Northern-Blot-Analyse der Zellen ergaben niedrige bis nicht nachweisbare Mengen mRNAs für die MHC-codierte Proteasomen-Komponenten LMP-7 und LMP-2 sowie die mutmaßlichen Peptid-Transporter TAP-1 und TAP-2. Northern blot analysis of the cells showed low to non-detectable amounts mRNAs for MHC-encoded proteasome components LMP-7 and LMP-2 as well as the putative peptide transporters TAP-1 and TAP-2.
  • [0007] [0007]
    Momburg et al. Momburg et al. (Nature 360: 174–177; 1992) offenbaren, dass die Transfektion von T2-Zellen (die kein TAP-1 und TAP-2 exprimieren) nur mit Ratten-TAP-1-cDNA die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen nicht veränderte, die endogene Peptide auf der Oberfläche der T-Klasse trugen. (Nature 360: 174-177; 1992) disclose that transfection of T2 cells (which do not TAP-1 and TAP-expressing 2) only with rat TAP-1 cDNA, the expression of MHC class I molecules not changed, carrying endogenous peptides on the surface of the T class. Die Transfektion nur mit TAP-2 führte zu einem leichten Anstieg der Expression, aber wenn TAP-1- und TAP-2-Rattentransporterproteine in T2-Zellen transfiziert wurden, wurde die Expression auf Spiegel wiederhergestellt, die 2- bis 3mal höher als in T1-Zellen waren. Transfection with TAP-2 resulted in a slight increase in expression, but when TAP-1 and TAP-2 rats transporter proteins were transfected into T2 cells, the expression was restored to levels 2 to 3 times higher than in T1 cells were. Sie schlossen aus ihren Ergebnissen, dass TAP-1 und TAP-2 zur Antigen-Präsentation benötigt wurden. They concluded from their results that TAP-1 and TAP-2 were required for antigen presentation.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG SUMMARY OF THE INVENTION
  • [0008] [0008]
    Die Erfinder haben überraschend entdeckt, dass trotz der mehrfachen antigenprozessierenden Defizienzen in CMT.64-Zellen, TAP-1 in die Zellen transfizierte, und es allein zur Induktion der CTL-Erkennung VSV-infizierter Zellen in Abwesenheit der IFN-γ-Induktion ausreichte. The inventors have surprisingly discovered that despite the multiple antigenprozessierenden deficiencies in CMT.64 cells, TAP-1 transfected into the cells, and it alone was sufficient to induce CTL recognition of VSV-infected cells in the absence of IFN-γ induction. Es wurde bedeutenderweise gezeigt, dass TAP-1 unabhängig von TAP-2 beim Peptid-Transport wirkt, da die transfizierten Zellen für die TAP-2-Expression negativ blieben. It has been shown, importantly, that TAP-1 independent of TAP-2 in peptide transport acts, as the transfected cells remained negative for TAP-2 expression. Es wurde auch gezeigt, dass TAP-1 allein spezifische Peptide an die Stelle des MHC-Zusammenbaus abgab, so dass sich stabile Komplexe bilden konnten, die anschließend zur Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert wurden, so dass eine Immunüberwachung durch cytotoxische T-Lymphozyten (CTL) ermöglicht wurde. It was also demonstrated that TAP-1 alone specific peptides gave the place of MHC assembly, so that stable complexes could form, which were then transported to the cell surface and expressed therein, so that an immune surveillance by cytotoxic T lymphocytes (CTL ) was possible.
  • [0009] [0009]
    Es wurde zudem gezeigt, dass einige Peptide im ER nur durch TAP-2 transloziert werden. It was also shown that some peptides are translocated in the ER by TAP-2 only. Es wurde beispielsweise gezeigt, dass TAP-2 allein bei Fehlen von TAP-1 zur Steigerung der Prozessierung und Präsentation des Influenza NP366-374-Peptids ausreicht. Example, it was shown that TAP-2 alone is sufficient in the absence of TAP-1 to increase the processing and presentation of influenza NP366-374 peptide.
  • [0010] [0010]
    Die Erfinder haben bedeutenderweise gezeigt, dass Mäuse, denen hohe Mengen CMT.64-Zellen injiziert wurden, die mit TAP-1 oder TAP-2 transfiziert worden waren, erhöhte Überlebensraten und signifikant gesenkte Pathologie und Metastase zeigen, verglichen mit Mäusen, denen Wildtyp-CMT.64-Zellen injiziert wurden. The inventors have significant example shown that mice lacking high amounts CMT.64 cells were injected, which had been transfected with TAP-1 and TAP-2, show increased survival rates and significantly lowered Pathology and metastasis, compared with mice injected with wild-type CMT.64 cells were injected.
  • [0011] [0011]
    Die Erfindung lehrt daher die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Immunantwort eines Säugetiers erhöht auf eine Tumorzelle, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, die T-Zellrezeptorinteraktive Antigene tragen und geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, wobei die medizinische Zusammensetzung der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthält, in die Tumorzelle und der Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen dient, so dass die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die T-Zellrezeptorinteraktive Antigene tragen, erhöht wird und die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers ermöglicht wird. The invention therefore teaches the use of a nucleic acid molecule comprising a TAP-1 coding sequence, for the manufacture of a medical composition comprising the immune response of a mammal increased to a tumor cell expressing low or non-detectable amounts of MHC class I molecules, the T carry -Zellrezeptorinteraktive antigens and expressing low or non-detectable amounts of TAP-1 and TAP-2, wherein the medical composition of the introduction of a nucleic acid molecule containing a TAP-1 coding sequence under the control of a suitable promoter, into the tumor cell and the expression serving of TAP-1 in the tumor cell under suitable conditions, so that the processing and presentation of MHC class I molecules, the T-cell receptor-interactive carry antigens, increased, and the detection is made possible by the immune response of the mammal. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die medizinische Zusammensetzung ein Vaccinia-Virus. In a preferred embodiment of the invention the medical composition comprises a vaccinia virus. Bei einer anderen Ausführungsform ist die Immunantwort eine cytolytische T-Lymphozyten-Antwort. In another embodiment, the immune response is a cytolytic T lymphocyte response.
  • [0012] [0012]
    Die Anmeldung schlägt daher eine Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls vor, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Steigerung der Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide auf der Oberfläche einer Zielzelle tragen, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und niedrige oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren. Therefore, the application proposes a use of a nucleic acid molecule comprising a TAP-1 coding sequence, for the manufacture of a medical composition for enhancing expression of MHC class I molecules bearing endogenous peptides on the surface of a target cell, the low or non- -erfassbare expressing quantities MHC class I molecules and express low or non-detectable amounts TAP-1 and TAP-2 transporter proteins. Die medizinische Zusammensetzung dient der Einführung von einem Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz, die TAP-1 unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kodiert, in die Zielzelle und zur Expression von TAP-1 in der Zielzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird. The medical composition is for introducing a nucleic acid molecule comprising a sequence encoding TAP-1 under the control of a suitable promoter encoded in the target cell, and expression of TAP-1 in the target cell under suitable conditions, whereby the processing and presentation of MHC class I molecules bearing endogenous peptides is increased. Die Zielzelle ist vorzugsweise eine Tumorzelle, die zudem eine Defizienz in den Proteasomen-Komponenten aufweist, am stärksten bevorzugt eine Kleinzell-Lungenkarzinomzelle. The target cell is preferably a tumor cell, which additionally has a deficiency in proteasome components, most preferably a small cell lung carcinoma cell. Bei einer Ausführungsform werden Prozessierung und Präsentation der endogenen Peptide, die das Motiv RGYVYQGL tragen, das auf K b restringiert ist, durch Einführung eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls erhöht. In one embodiment, processing and presentation of endogenous peptides bearing the motif RGYVYQGL, which is restricted to K b, enhanced by the introduction of a TAP-1 encoding nucleic acid molecule. Bei einer zweiten, nicht-erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Prozessierung und Präsentation endogener Peptide, die das an H-2D b bindende Motiv ASNENMETM haben, durch Einführung eines TAP-2 kodierenden Nukleinsäuremoleküls erhöht. In a second, non-inventive embodiment, processing and presentation of endogenous peptides that have the H-2D b binding motif ASNENMETM, increased by introducing a TAP-2 encoding nucleic acid molecule.
  • [0013] [0013]
    Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein Nukleinsäuremolekül mit einer TAP-1 kodierenden Sequenz und ein zweites Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ein Antigenpeptid, vorzugsweise ein T-Zellrezeptorinteraktives Antigen, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors kodiert, in die Zielzelle eingeführt. In one embodiment of the use according to the invention is a nucleic acid molecule with a TAP-1 coding sequence and a second nucleic acid molecule having a sequence that antigen peptide is a, preferably a T-cell receptor-interactive antigen, under control of a suitable promoter encoded introduced into the target cell.
  • [0014] [0014]
    Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines rekombinanten Virusvektors, umfassend eine TAP-1 kodierende Nukleotidsequenz und eine Nukleotidsequenz, die einen Antigenpeptid-Vektor kodiert, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Erhöhung der Zelloberflächen-Expression eines MHC-Klasse-I-Moleküles, das endogene Peptide trägt, in einer Tumorzelle, die geringe oder nicht- erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert und niedrige oder nicht-erfassbare Mengen der Transporterproteine TAP-1 und TAP-2 exprimiert. The invention also relates to the use of a recombinant viral vector comprising an encoding TAP-1 nucleotide sequence and a nucleotide sequence encoding an antigenic peptide vector for preparing a medical composition to enhance cell surface expression of an MHC class I molecule, the endogenous peptides bears, in a tumor cell expressing low or non-detectable amounts of MHC class I molecules and expressing low or non-detectable amounts of the transporter proteins TAP-1 and TAP-2.
  • [0015] [0015]
    Die Anmeldung lehrt zudem weiter eine medizinische Zusammensetzung zur Erhöhung der Immunreaktion eines Säugetiers auf eine Tumorzelle, die niedrige oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, welche endogene Peptide tragen. In addition, the application further teaches a medical composition for enhancing the immune response of a mammal to a tumor cell, the low or not detectable amounts MHC class I molecules expressed, which carry endogenous peptides. Die medizinischen Zusammensetzung dient der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors, in die Tumorzelle und der Expression von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers, insbesondere die Erkennung durch cytolytische T-Zellen, erlaubt. The medical composition is for introducing a nucleic acid molecule comprising a TAP-1 coding sequence under the control of a suitable promoter, into the tumor cell and the expression of TAP-1 in the tumor cell under suitable conditions, whereby the processing and presentation of MHC class -I molecules bearing endogenous peptides is increased, the detection by the immune response of the mammal, particularly recognition by cytolytic T cells allowed.
  • [0016] [0016]
    Bei einer Ausführungsform wird das Nukleinsäuremolekül in die Tumorzelle in ein Vaccinia-Virus eingeführt. In one embodiment, the nucleic acid molecule is introduced into the tumor cell in a vaccinia virus. Eine bevorzugte Ausführungsform umfasst das Einführen eines zusätzlichen Nukleinsäuremoleküls in die Tumorzelle, wobei das zusätzliche Nukleinsäuremolekül umfasst eine Sequenz, die ein Antigenpeptid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors codiert, und das Exprimieren des Antigenpeptids in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und die Präsentation der MHC-Klasse-I-Moleküle erhöht wird, die das Antigenpeptid tragen, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers, am stärksten bevorzugt die cytolytische T-Lymphozyten des Säugetiers, erlaubt. A preferred embodiment comprises introducing an additional nucleic acid molecule into the tumor cell, said additional nucleic acid molecule comprises a sequence encoding an antigenic peptide under control of a suitable promoter, and expressing said antigen peptide in the tumor cell under suitable conditions, whereby the processing and presentation of is MHC class I molecules increased, which carry the antigen peptide, recognition by the immune response of the mammal, most preferably, the cytolytic T lymphocytes of the mammal permits. Bei einer bestimmten Ausführungsform kann das Virus als Impfstoff zur Erhöhung der Immunantwort auf das Antigenpeptid verwendet werden. In a particular embodiment the virus can be used as a vaccine to enhance the immune response to the antigen peptide.
  • [0017] [0017]
    Die Anmeldung beschreibt zudem die Herstellung tumorspezifischer T-Zellen, die Anti-Tumoreigenschaften aufweisen, umfassend das Entfernen von Tumorzellen aus einem Individuum; The application also describes in detail the preparation of tumor specific T cells which have anti-tumor properties, the removal of tumor cells from a subject; Einführen eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in die Tumorzellen, wobei die medizinische Zusammensetzung nach Anspruch 1 verwendet wird; Introducing a nucleic acid molecule encoding TAP-1 under the control of a suitable promoter into the tumor cells, wherein the medical composition is used according to claim 1; Einpflanzen der Tumorzellen in das Individuum oder ein Säugetier mit einem wiederhergestellten Immunsystem des Individuums; Implanting the tumor cells in the subject or a mammal with a reconstituted immune system of the individual; und Ernten tumorspezifischer T-Zellen. and harvesting tumor specific T cells. Die tumorspezifischen T-Zellen können als Therapeutikum in vivo in dem Individuum verwendet werden. The tumor-specific T cells can be used as a therapeutic agent in vivo in the subject.
  • [0018] [0018]
    Diese und andere Aspekte der Erfindung werden anhand der folgenden eingehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnungen ersichtlich. These and other aspects of the invention will become apparent from the following detailed description and the accompanying drawings. Zudem werden verschiedene Veröffentlichungen herangezogen, die hiermit durch Bezugnahme ganz aufgenommen sind. In addition, various publications are used, which are hereby incorporated entirely by reference.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
  • [0019] [0019]
    Es zeigt: It shows:
  • [0020] [0020]
    1A 1A , Histogramme, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten RMA- und RMA-S-IFN-γ-induzierten (+) oder uninduzierten Zellen, CMT.64-Zellen (abgekürzt: C); , Histograms, the CTL recognition of VSV infected RMA and RMA-S IFN-γ induced (+) or uninduced cells, CMT.64 cells (abbreviated: C);
  • [0021] [0021]
    1B 1B , Histogramme, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen (abgekürzt: C); , Histograms, the CTL recognition of VSV-infected CMT.64 cells (abbreviated: C);
  • [0022] [0022]
    2 2 , ein Autoradiogramm, die Menge von β 2 m, synthetisiert in RMA-, RMA-S und IFN-γ-induzierten (+) oder nicht induzierten (–) CMT.64 Zellen; , An autoradiogram, the amount of β 2 m synthesized in RMA, RMA-S and IFN-γ induced (+) or not induced (-) CMT.64 cells;
  • [0023] [0023]
    3 3 , ein Histogramm, die Wirkung von β 2 m auf die CTL-Antwort gegen CMT.64-Zellen, die mit Vaccinia- und Vaccinia-β 2 m-Rekombinante (V-Vb2), Vaccinia und VSV (V-VSV) oder Vaccinia-β 2 m und VSV (Vb2-VSV) superinfiziert sind, wobei das Insert die synthetisierte β 2 m-Menge nach der Immunfällung mit dem anti-hβ 2 m-Kaninchenserum zeigt; , A histogram of the effect of β 2 m on the CTL response against CMT.64 cells infected with Vaccinia and Vaccinia-β 2 m recombinant (V-Vb2), Vaccinia and VSV (V-VSV), or Vaccinia -β 2 m and VSV (VSV-V b2) are superinfected, wherein the insert shows the synthesized β 2 m-quantity after immunoprecipitation with the anti-hβ 2 m-rabbit serum;
  • [0024] [0024]
    4 4 , Autoradiogramme, den intrazellulären Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle, D b und K b ; , Autoradiographs, the intracellular transport of MHC class I molecules, D b and K b;
  • [0025] [0025]
    5 5 , Autoradiogramme, den intrazellulären Transport freier und zusammengebauter Formen von K b -Molekülen in uninduzierten und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen; , Autoradiographs, the intracellular transport of free and assembled forms of K b molecules in uninduced and IFN-γ-induced CMT.64 cells;
  • [0026] [0026]
    6 6 , ein Histogramm, die VSV-N 52-59-Peptid-Dosisantwort bei der CTL-Erkennung für CMT.64-Zellen (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) und RMA-S-Zellen (RMA-S); , A histogram, the VSV-N 52-59 peptide dose response in CTL recognition for CMT.64 cells (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) and RMA-S-cells (RMA-S);
  • [0027] [0027]
    7 7 , eine Northern-Blot-Analyse von Cytoplasma-RNA aus RMA-, RMA-S-, CMT.64-IFN-γ-induzierten und nicht-induzierten Zellen; , A Northern blot analysis of cytoplasmic RNA from RMA, RMA-S, CMT.64 IFN-γ induced and uninduced cells;
  • [0028] [0028]
    8 8 die zweidimensionale Gelanalyse von Proteasomenkomponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64 IFN-γ-induzierten oder nicht induzierten Zellen; the two-dimensional gel analysis of Proteasomenkomponenten from RMA, RMA-S and IFN-γ-induced CMT.64 or uninduced cells;
  • [0029] [0029]
    9 9 CMT 64 (CMT), und CMT 64, transfiziert mit TAP-1 (CMT TAP 1), infiziert mit oder ohne VSV für 8 Std. bei einer MOI von 5, oder behandelt mit N52-59-Peptid für 2 Std. bei 500 Pm (50% Dosisantwort); CMT 64 (CMT), and CMT 64 transfected with TAP-1 (CMT TAP 1) infected with or without VSV for 8 hr. At a MOI of 5, or treated with N52-59 peptide for 2 hr. At 500 Pm (50% dose response);
  • [0030] [0030]
    10 10 TAP-Genexpressionsprofile von CMT.64 und CMT64/r1-4; TAP gene expression profiles of CMT.64 and CMT64 / r1-4;
  • [0031] [0031]
    11 11 , eine Durchflusscytometrienanalyse, dass die TAP-1-Expression zur Erhöhung der Mengen von K b und D b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen hinreicht; A Durchflusscytometrienanalyse that the TAP-1 expression to increase the amounts of K b and D b is sufficient at the cell surface of CMT.64 cells;
  • [0032] [0032]
    12 12 Pulse-Chase-Analyse von K b und D b -Molekülen aus CMT.64- und TAP-1-transfizierten CMT.64-Zellen (CMT64/r1-4); Pulse-chase analysis of K b and D b molecules from CMT.64- and TAP-1 transfected CMT.64 cells (CMT64 / r1-4);
  • [0033] [0033]
    13 13 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte CMT.64 Zellen (SMT-r1.4) effizient Antigen an VSV-spezifische CTL präsentieren; a histogram that TAP-1-transfected cells CMT.64 (SMT R1.4) efficiently present antigen to VSV-specific CTL;
  • [0034] [0034]
    14 14 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen effizient Antigen an VSV-spezifische CTL präsentieren; a histogram that TAP-1-transfected cells CMT.64 efficiently present antigen to VSV-specific CTL;
  • [0035] [0035]
    15 15 ein Histogramm, dass TAP-1-transfizierte Klone effizient Antigen an VSV-spezifische CL präsentieren; a histogram that TAP-1-transfected clones efficiently present antigen to VSV-specific CL;
  • [0036] [0036]
    16 16 , ein Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach Influenza-Infektion erkannt werden, und CMT-64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, nicht erkannt werden; , A histogram that RMA cells and CMT.64 cells treated with IFN-γ are recognized efficiently after influenza infection, and CMT-64 cells that were transfected with the rat TAP-1 gene are not recognized;
  • [0037] [0037]
    17 17 , ein Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach Influenza-Infektion erkannt werden, und CMT.64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, nicht erkannt werden; , A histogram that RMA cells and CMT.64 cells treated with IFN-γ are recognized efficiently after influenza infection and CMT.64 cells transfected with the rat TAP-1 gene are not recognized;
  • [0038] [0038]
    18 18 , eine Histogramm, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, CMT.64-Zellen, die mit beiden TAP-Genen der Ratte transfiziert wurden, nach einer Influenza-Virusinfektion erkannt werden; , A histogram that RMA cells and CMT.64 cells treated with IFN-γ, CMT.64 cells transfected with both rat TAP genes are recognized after influenza virus infection;
  • [0039] [0039]
    19 19 ein Histogramm, dass HSV-infizierte Zellen durch spezifische CTL unabhängig von der Expression von Ratten-TAP1 und/oder TAP-2-Transportergenen erkannt werden; a histogram that HSV-infected cells are recognized by specific CTL independent of the expression of rat TAP1 and / or TAP-2 transporter genes; und and
  • [0040] [0040]
    20 20 , eine Schaubild, das Überleben von C57BI/6- und Balb/C-Mäusen, denen 5 × 10 5 CMT.64 oder CMT.12.12-Zellen injiziert wurden. A graph showing the survival of C57BI / 6 and Balb / C mice injected with 5 × 10 5 or CMT.12.12 CMT.64 cells were injected.
  • EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • [0041] [0041]
    Wie vorstehend erwähnt haben die Erfinder überraschend gezeigt, dass das TAP-1-allein, in der Abwesenheit von TAP-2 zur Erhöhung der Prozessierung und der Präsentation der VSV-Peptide an die intrazelluläre Stelle des MHC-Zusammenbaus ausreicht, so dass stabile Komplexe aus MHC-Klasse-I-Molekülen und endogenem Peptid gebildet, an die Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert werden können. As mentioned above, the inventors have surprisingly shown that the, sufficient TAP-1 alone in the absence of TAP-2 in order to increase the processing and presentation of VSV peptides to the intracellular site of MHC assembly, allowing stable complexes of MHC-class-I-molecules and endogenous peptide formed, can be transported to the cell surface and expressed therein. Sie zeigten auch, dass nur TAP-2 in Abwesenheit von TAP-1 zur Erhöhung der Prozessierung und der Präsentation des Influenza-NP366-374-Peptids ausreicht. They also showed that only TAP-2 in the absence of TAP-1 to increase the processing and presentation of the influenza NP366-374 peptide-sufficient.
  • [0042] [0042]
    Die Erfindung betrifft folglich die Verwendung einer Nukleinsäure, umfassend eine TAP-1 kodierende Sequenz, zur Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung, welche die Expression von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide auf der Oberfläche einer Zielzelle tragen, erhöht, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert, und geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Trartsporterproteine exprimiert. The invention thus relates to the use of a nucleic acid comprising a TAP-1 coding sequence, for the manufacture of a medical composition which increases the expression of MHC class I molecules bearing endogenous peptides on the surface of a target cell, with little or not detectable amounts of MHC class I molecules expressed, and expressing low or non-detectable amounts of TAP-1 and TAP-2-Trartsporterproteine. Die medizinische Zusammensetzung dient der Einführung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors enthält, in die Zielzelle und zur Expression von TAP-1 in der Zielzelle unter geeigneten Bedingungen, so dass die Prozessierung und die Präsentation von MHC-Klasse-I-Molekülen, die endogene Peptide tragen, erhöht wird. The medical composition is for introducing a nucleic acid molecule containing a TAP-1 coding sequence under the control of a suitable promoter, into the target cell, and expression of TAP-1 in the target cell under suitable conditions, so that the processing and presentation of MHC class I molecules bearing endogenous peptides is increased.
  • [0043] [0043]
    Zielzellen, die geringe oder nicht erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren und geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren, können durch Verfahren des Standes der Technik ausgewählt werden. Target cells expressing low or non-detectable amounts of MHC class I molecules and express little or no detectable amounts of TAP-1 and TAP-2 transporter proteins can be selected by methods known in the art. Eine Zielzelle kann beispielsweise mit einem rekombinanten Virusvektor infiziert werden, wie VSV, und durch VSV-spezifische cytolytische T-Zellen auf Lyse untersucht werden. A target cell can be infected, for example, with a recombinant virus vector such as VSV, and are examined by VSV specific cytolytic T cells to lysis. Die FACS-Analyse kann ebenfalls zur Erfassung der MHC-Klasse-I-Moleküle auf der Oberfläche einer mutmaßlichen Zielzelle verwendet werden. FACS analysis may also be used to detect MHC class I molecules on the surface of a putative target cell. Die Biosynthese und der intrazelluläre Transport von MHC-Klasse-I-Molekülen kann ebenfalls biochemisch charakterisiert werden. The biosynthesis and intracellular transport of MHC class I molecules may also be biochemically characterized. Endo-H beispielsweise, das N-verknüpfte Oligosaccharide nur spaltet, wenn sie in der High-Mannose-Form vorliegen, die für Proteine, die im ER und cis-Golgi-Komplex vorkommen, charakteristisch ist, können zum Messen des intrazellulären Transports verwendet werden. Endo-H, for example, the N-linked oligosaccharides only cleaves when they are present in the high-mannose form suitable for proteins present in the ER and cis-Golgi complex, is characteristic, can be used to measure intracellular transport , Pulse-Chase-Methodik kann ebenfalls zur Bestätigung von Zielzellen verwendet werden, die geringe Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren. Pulse-chase methodology may also be utilized to confirm target cells expressing low amounts of MHC class I molecules. Die vorstehenden Verfahren sind in den Beispielen hier beschrieben. The above methods are described in the examples herein. Siehe ebenfalls Restifo, NP et al., siehe oben. See also Restifo, NP et al., Supra.
  • [0044] [0044]
    Beispiele für Zellen, die niedrige Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimieren, können von Kolon-, Brust-, Lungenmesotheliom- und Lungenkrebs mit Kleinzellhistologie hergeleitet werden (siehe Restifo, NP siehe oben). Examples of cells which express low levels of MHC class-I molecules, can be derived from colon, breast, and lung cancer with Lungenmesotheliom- Kleinzellhistologie (see Restifo, NP see above).
  • [0045] [0045]
    Zellen, die geringe oder nicht erfassbare Mengen TAP-1- und TAP-2-Transporterproteine exprimieren, können durch Untersuchung auf mRNA, die diese Proteine codiert, beispielsweise mittels Northern-Blot-Analyse, wie in den Beispielen hier beschrieben, erfasst werden. Cells that express low or non-detectable amounts of TAP-1 and TAP-2 transporter proteins may be obtained by testing for mRNA encoding these proteins, for example by Northern blot analysis, as described in the examples herein, is detected. Beispiele für Zellen, die niedrige Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimieren, sind Tumorzellen, die von Lungenkrebs mit Kleinzellhistologie hergeleitet sind. Examples of cells that have low amounts of TAP-1 and TAP-2 expressing tumor are cells that are derived from lung cancer with Kleinzellhistologie.
  • [0046] [0046]
    Zielzellen können neben der Expression geringer oder nicht erfassbarer Mengen der Transporterproteine TAP-1 und TAP-2, geringe oder nicht erfassbare Mengen von einer oder mehreren Komponenten des Proteasoms exprimieren, beispielsweise LMP-7 und LMP-2. Target cells can express little or no detectable amounts of the transporter proteins TAP-1 and TAP-2, low or non-detectable amounts of one or more components of the proteasome addition to the expression, such as LMP-7 and LMP-2.
  • [0047] [0047]
    Beispiele für endogene Peptide, deren Expression mit den erfindungsgemäßen Verfahren erhöht werden kann, umfassen Antigene, die mit cytolytischen T-Zellen wechselwirken und diese aktivieren, beispielsweise virale Antigene, wie das VSV-N52-59-Peptid, Influenza NP 366–374 und tumorasssoziierte Antigene. Examples of endogenous peptides whose expression may be increased by the methods of the invention include antigens that interact with cytolytic T cells and activate them, for example, viral antigens such as the VSV-N52-59 peptide, influenza NP 366-374 and tumor-associated antigens. Die hier beschriebenen Untersuchungen legen nahe, dass endogene Peptide mit dem Motiv ASNENMETM, die an D b binden, von TAP-2 transportiert werden und endogene Peptide mit dem Motiv RGYVYQGL, die an K b binden, von TAP-1 transportiert werden. The studies described here suggest that endogenous peptides with the design ASNENMETM that bind to D b, are transported by TAP-2 and endogenous peptides with the design RGYVYQGL that bind to K b, are transported by TAP-1. Daher kann die Erhöhung der Expression der vorherigen endogenen Peptide nach den hier beschriebenen Verfahren erzielt werden mit einem Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-2 kodierende Sequenz enthält, und die Erhöhung der Expression von Letzterem kann erzielt werden durch Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz enthält. Therefore, the increase in expression of the preceding endogenous peptides may be achieved by the methods described herein with a nucleic acid molecule containing a TAP-2 coding sequence, and the increase in the expression of the latter may be achieved by using a nucleic acid molecule encoding a TAP-1 coding sequence.
  • [0048] [0048]
    Das Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, kann leicht mit Techniken des Standes der Technik synthetisiert werden. The nucleic acid molecule comprising a sequence encoding TAP-1 under the control of a suitable promoter may be readily synthesized using techniques of the prior art. Eine TAP-1 kodierende Sequenz umfasst eine Sequenz, die ein Protein mit der Aminosäuresequenz kodiert, wie sie offenbart ist in Trowsdale, J. et al., Nature 348: 741, 1990 und in der Internationalen Anmeldung Nr. PCT/US91/06105, veröffentlicht am 19. März 1992. Ein Nukleinsäuremolekül, das eine TAP-1 kodierende Sequenz umfasst, kann isoliert und sequenziert werden, beispielsweise durch Synthese von cDNAs, aus RNA und mit der raschen Amplifikation von cDNA-Enden (RACE, Frohman, et al., 1988) mit Oligonukleotiden, die für TAP-1 spezifisch sind und Analyse der Sequenz der Klone, die nach der Amplifikation erhalten werden. A TAP-1 coding sequence comprises a sequence encoding a protein having the amino acid sequence as disclosed in Trowsdale, J. et al, Nature 348:. 741, 1990 and in the International Application No. PCT / US91 / 06105. published March 19, 1992. A nucleic acid molecule comprising a sequence encoding TAP-1 can be isolated and sequenced, for example by synthesis of cDNAs from RNA and using rapid amplification of cDNA ends (RACE, Frohman, et al. , 1988) using oligonucleotides specific for TAP-1 and analysis of the sequence of the clones obtained following amplification. Oligonukleotide, die spezifisch für TAP-1 sind, können identifiziert werden, indem die Nukleinsäuresequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit bekannten TAP-1-Sequenzen verglichen werden. Oligonucleotides specific for TAP-1 may be identified by the nucleic acid sequence of the nucleic acid molecules of the invention are compared with known TAP-1 sequences. Nukleinsäuremoleküle, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, und die TAP-1 kodieren, können ebenfalls durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Nucleic acid molecules which are used in the inventive method, and encoding TAP-1 may also be constructed by methods of the prior art by chemical synthesis and enzymatic ligation reactions. Die TAP-1 kodierende Sequenz kann ebenfalls mit DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. The sequence encoding TAP-1 may also be prepared using recombinant DNA methods.
  • [0049] [0049]
    Einige der Verwendungen, die hier vorgeschlagen werden, verwenden Nukleinsäuremoleküle, die Sequenzen enthalten, welche verkürzte nicht-funktionelle Formen von TAP-1 kodieren. Some of the uses that are proposed here, using nucleic acid molecules containing sequences that encode truncated non-functional forms of TAP-1. Verkürzte nicht-funktionelle Formen von TAP-1 können identifiziert werden, indem Anteile des TAP-1-Gens deletiert werden, so dass Fragmente erhalten werden. Reduced non-functional forms of TAP-1 can be identified by shares of TAP-1 gene are deleted so that fragments are obtained. Solche Fragmente sollten mit den TAP-1 oder TAP-2-Sequenzen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Such fragments should hybridize to the TAP-1 or TAP-2 sequences under stringent hybridization conditions. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind so stringent, dass sie Spezifität schaffen, die Anzahl von Fehlpaarungen reduzieren und dennoch hinreichend flexibel sind, dass sie die Bildung stabiler Hybride in einer akzeptablen Rate ermöglichen. Stringent hybridization conditions are so stringent that they provide specificity, reduce the number of mismatches and yet are sufficiently flexible to allow the formation of stable hybrids at an acceptable rate. Diese Bedingungen sind dem Fachmann geläufig und sind beispielsweise beschrieben in Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). These conditions are known to the expert and are described for example in Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor). Die Fähigkeit der verkürzten Formen von TAP-1 und TAP-2 zum Transport von endogenen Peptiden kann mit den hier beschriebenen Verfahren bestimmt werden. The ability of the truncated forms of TAP-1 and TAP-2 for the transport of endogenous peptides can be determined using the methods described herein.
  • [0050] [0050]
    Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die TAP-1 kodiert, können auf bekannte Weise in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden, der eine gute Expression des Proteins oder eines Teils davon gewährleistet. Nucleic acid molecules having a sequence encoding TAP-1 can be incorporated in a known manner into an appropriate expression vector which ensures good expression of the protein or a portion thereof. Mögliche Expressionsvektoren umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren, so lange der Vektor mit der verwendeten Zielzelle kompatibel ist. Possible expression vectors include, but are not limited to cosmids, plasmids or modified viruses, so long as the vector is compatible with the target cell used.
  • [0051] [0051]
    Es wird erwogen, dass die hier beschriebenen Nukleinsäuremoleküle die notwendigen Elemente zur Transkription und Translation der eingeführten Sequenz enthalten. It is contemplated that the nucleic acid molecules described herein contain the necessary elements for transcription and translation of the inserted sequence. Geeignete Transkriptions- und Translationselemente können hergeleitet werden von einer Vielzahl von Quellen, und dazu gehören Bakterien-, Pilz-, Viren-, Säugetier- oder Insekten-Gene. Suitable transcription and translation elements can be derived from a variety of sources, and include bacterial, fungal, viral, mammalian or insect genes. Die Selektion geeigneter Transkriptions- und Translationselemente hängt ab von der ausgewählten Zielzelle, wie nachstehend erörtert, und kann leicht vom Durchschnittsfachmann bewerkstelligt werden. The selection of suitable transcription and translation elements depends on the selected target cell as discussed below, and may be readily accomplished by one of ordinary skill in the art. Beispiele für solche Elemente umfassen: einen Transkriptionspromotor und -Enhancer oder RNA-Polymerasebindungssequenz, eine Ribosomenbindungssequenz, wie ua ein Translationsinitiationssignal. Examples of such elements include: a transcriptional promoter and enhancer or RNA polymerase binding sequence, a ribosome binding sequence, such as, inter alia, a translation initiation signal. Zudem können je nach der ausgewählten Wirtszelle und dem eingesetzten Vektor andere genetische Elemente, wie ein Replikationsursprung, zusätzliche DNA-Restriktionsstellen, Enhancer und Sequenzen, die die Induzierbarkeit der Transkription verleihen, in den Expressionsvektor eingeführt werden. In addition, depending on the host cell chosen and the vector employed, other genetic elements such as an origin of replication, additional DNA restriction sites, enhancers, and sequences conferring inducibility of transcription may be introduced into the expression vector. Es wird auch erwogen, dass die nötigen Transkriptions- und Translationselemente vom nativen TAP-1-Gen, TAP-2-Gen und/oder ihren flankierenden Bereichen zugeführt wird. It is also contemplated that the necessary transcription and translation elements is supplied by the native TAP-1 gene, TAP-2 gene and / or its flanking regions.
  • [0052] [0052]
    Die Nukleinsäuremoleküle können auch ein Reportergen enthalten, das die Selektion transformierter oder transfizierter Wirtszellen erleichtert. The nucleic acid molecules may also contain a reporter gene which facilitates the selection of transformed or transfected host cells. Beispiele für Reportergene sind Gene, die ein Protein, wie β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase oder ein Immunglobulin oder einen Abschnitt davon, wie den Fc-Abschnitt eines Immunglobulins, vorzugsweise IgG, enthalten. Examples of reporter genes are genes encoding a protein such as β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, firefly luciferase, or an immunoglobulin or a portion thereof, containing as the Fc portion of an immunoglobulin, preferably IgG. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reportergen IacZ. In a preferred embodiment, the reporter gene lacZ. Die Transkription des Reportergens wird überwacht durch Konzentrationsänderungen des Reporterproteins, wie β-Galactosidase, Chloramphenicolacetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase. The transcription of the reporter gene is monitored by changes in the concentration of the reporter protein, such as β-galactosidase, chloramphenicol acetyltransferase, firefly luciferase. Dies ermöglicht das Sichtbarmachen und Untersuchen auf die Expression von TAP-1. This allows the visualization and assaying for the expression of TAP-1.
  • [0053] [0053]
    Nukleinsäuremoleküle, die eine TAP-1 kodierende Sequenz umfassen, können in die Zielzelle über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation usw. eingebracht werden. Nucleic acid molecules comprising a sequence encoding TAP-1 may be introduced into the target cell via transformation, transfection, infection, electroporation, etc.. Verfahren zur Transformation, Transfektion usw. von Wirtszellen zur Expression von Fremd-DNA sind Stand der Technik (siehe beispielsweise Itakura et al., US-Patent 4,704,362; Hinnen et al., PNAS USA 75: 1929–1933, 1978; Murray et al., US-Patent Nr. 4,801,542; Upshall et al., US-Patent 4,935,349; Hagen et al., US-Patent 4,784,950; Axel et al., US-Patent 4,399,216; Goeddel et al., US-Patent 4,766,075; und Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2te Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, die jeweils durch Bezugnahme aufgenommen sind). Methods for transformation, transfection, etc. host cells to express foreign DNA are well known in the art (see, e.g., Itakura et al, U.S. Patent 4,704,362; Hinnen et al, PNAS USA. 75:. 1929-1933, 1978; Murray et al ., US Patent No. 4,801,542;. Upshall et al, US Patent 4,935,349;. Hagen et al, US Patent 4,784,950;. Axel et al, US Patent 4,399,216;. Goeddel et al, US Patent 4,766,075 and FIG. Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, each incorporated by reference).
  • [0054] [0054]
    Geeignete Expressionsvektoren zum Steuern der Expression in Säugetierzellen umfassen gewöhnlich einen Promotor, sowie andere Transkriptions- und Translations-Kontrollsequenzen. Suitable expression vectors for directing expression in mammalian cells generally include a promoter, as well as other transcriptional and translational control sequences. Allgemeine Promotoren umfassen SV40, MMTV, Metallothionein-1, Adenovirus Ela, CMV, Immediate Early, Immunglobulin Schwere-Ketten-Promotor und Enhancer und RSV-LTR. General promoters include SV40, MMTV, metallothionein-1, adenovirus Ela, CMV immediate early, immunoglobulin heavy chain promoter and enhancer, and RSV-LTR. Protokolle zur Transfektion von Säugetierzellen sind dem Fachmann geläufig. Protocols for the transfection of mammalian cells are familiar to the expert.
  • [0055] [0055]
    Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Nukleinsäuremolekül in die Zielzelle in einem viralen Vektor, vorzugsweise einem Vaccinia-Virus-Vektor, am stärksten bevorzugt attenuiert, eingebracht. In a preferred embodiment, the nucleic acid molecule into the target cell in a viral vector, preferably a vaccinia viral vector, most preferably attenuated, is introduced. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Vaccinia-Viren umfassen P7.5 (Cochran, MA et al., 1985, J. Virol. 54:30), P11 (Bertholet, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2096), CAE-1 (Patel, DD et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9431). Suitable promoters for use with vaccinia viruses include P7.5 (Cochran, MA et al., 1985, J. Virol. 54:30), P11 (Bertholet, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci . USA 82: 2096), CAE-1 (Patel, DD et al, 1988, Proc Natl Acad Sci USA 85:..... 9431).
  • [0056] [0056]
    Das Nukleinsäuremolekül kann in eine nicht-essentielle Stelle eines Vaccinia-Virus-Vektors eingeführt werden. The nucleic acid molecule can be introduced into a non-essential site of a vaccinia virus vector. Diese nicht-essentiellen Stellen sind bekannt und beispielsweise beschrieben in Perkus et al., 1986, Virology: 285; These non-essential positions are known and described for example in Perkus et al, 1986, Virology 285;. Hruby et al., 1983, Proc. Hruby et al., 1983, Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci. USA 80: 3411 und; USA 80: 3411 and; Weir und Moss, 1983, J. Virol. Weir and Moss, 1983, J. Virol. 46: 530). 46: 530). Rekombinante Viren, die TAP-1 exprimieren, können leicht mit Techniken des Standes der Technik identifiziert werden, die beispielsweise in Moss, B. 1992, (Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158: 25) erörtert sind. Recombinant viruses expressing TAP-1 may be readily identified with the techniques of the prior art, for example, in Moss, B., 1992, (Curr Topics Microbiol Immunol 158:... 25) are discussed.
  • [0057] [0057]
    Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ein antigenes Peptid, vorzugsweise ein pathogenes Peptid, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, in die Zielzelle eingebracht. In a preferred embodiment, an additional nucleic acid molecule having a sequence encoding an antigenic peptide, preferably a pathogenic peptide, comprising, under the control of a suitable promoter, are introduced into the target cell.
  • [0058] [0058]
    Wie vorstehend erwähnt, haben die Erfinder gezeigt, dass TAP-1 allein die Expression von Komplexen aus MHC-Klasse-I-Molekülen und endogenem Peptid auf der Oberfläche von Zielzellen steigern kann, wodurch die Zielzellen gegenüber der Immunüberwachung durch CTL anfällig sind. As mentioned above, the inventors have demonstrated that TAP-1 alone can enhance expression of complexes of MHC class I molecules and endogenous peptide on the surface of target cells, whereby the target cells to immune surveillance by CTL are susceptible.
  • [0059] [0059]
    Folglich stellt die vorliegende Anmeldung eine medizinische Zusammensetzung bereit, welche die Immunantwort eines Säugetiers auf eine Tumorzelle erhöht, die geringe oder nicht-erfassbare Mengen MHC-Klasse-I-Moleküle exprimiert und die geringe oder nicht-erfassbare Mengen TAP-1 und TAP-2 exprimiert. Accordingly, the present application provides a medical composition which increases the immune response of a mammal to a tumor cell expressing low or non-detectable amounts of MHC class I molecules and the low or non-detectable amounts of TAP-1 and TAP-2 expressed. Die medizinische Zusammensetzung dient dem Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine TAP-1 kodierende Sequenz unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, in die Tumorzelle und dem Exprimieren von TAP-1 in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Prozessierung und Präsentation von einer oder mehreren endogenen Peptiden erhöht wird, wodurch die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt wird. The medical composition is for introducing a nucleic acid molecule comprising a TAP-1 coding sequence under the control of a suitable promoter, into the tumor cell and expressing TAP-1 in the tumor cell under suitable conditions, whereby the processing and presentation of one or more is increased endogenous peptides, whereby the detection is allowed by the immune response of the mammal.
  • [0060] [0060]
    Bei einer bevorzugten Ausführungsform dient die medizinischen Zusammensetzung dem Einbringen eines zusätzlichen Nukleinsäuremoleküls, umfassend eine Sequenz, die ein Antigenpeptid unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, und dem Exprimieren des Antigenpeptids in der Tumorzelle unter geeigneten Bedingungen, wodurch die Präsentation und die Prozessierung des Antigenpeptids ermöglicht wird, was die Erkennung durch die Immunantwort des Säugetiers erlaubt. In a preferred embodiment, the medical composition is for introducing an additional nucleic acid molecule comprising a sequence which comprises an antigen peptide under the control of a suitable promoter, and expressing said antigen peptide in the tumor cell under suitable conditions, whereby the presentation and processing of the antigen peptide allows is what permits the detection by the immune response of the mammal.
  • [0061] [0061]
    Die Erfindung betrifft zudem die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung zur Herstellung von tumorspezifischen T-Zellen, die Anti-Tumoreigenschaften besitzen. The invention also relates to the preparation of a medical composition for preparing tumor specific T cells which have anti-tumor properties. Dies umfasst die Entfernung der Tumorzellen aus einem Individuum; This includes removal of tumor cells from a subject; Einbringen eines TAP-1 kodierenden Nukleinsäuremoleküls unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors in die Tumorzellen; Introducing a nucleic acid molecule encoding TAP-1 under the control of a suitable promoter into the tumor cells; Einpflanzen der Tumorzellen in das Individuum oder ein Säugetier mit einem wiederhergestellten Immunsystem des Individuums; Implanting the tumor cells in the subject or a mammal with a reconstituted immune system of the individual; und Ernten der tumorspezifischen T-Zellen. and harvesting tumor specific T cells. Es wird angenommen, dass bei einer Ausführungsform das Nukleinsäuremolekül ebenfalls sowohl TAP-1 als auch TAP-2 kodieren kann oder dass separate Nukleinsäuremoleküle, die TAP-1 und TAP-2 kodieren, in die Tumorzellen eingebracht werden können. It is believed that in one embodiment, the nucleic acid molecule can both TAP-1 and TAP-2 or that separate also encode nucleic acid molecules encoding TAP-1 and TAP-2, can be introduced into the tumor cells. Die tumorspezifischen T-Zellen können als Therapeutikum in vivo in dem Individuum verwendet werden. The tumor-specific T cells can be used as a therapeutic agent in vivo in the subject. Verfahren wie sie in Restifo, NP et al., J. Exp. Med. 175: 1423–1431 beschrieben sind, können zur Herstellung spezifischer T-Zellen verwendet werden, deren In vivo-Antitumoreigenschaften Tumorzellen verwenden, die mit IFN-γ transfiziert sind. A method as defined in Restifo, NP et al, J. Exp Med 175:... Are described 1423-1431, can be used to prepare specific T cells, their use in vivo anti-tumor properties of tumor cells transfected with IFN-γ ,
  • [0062] [0062]
    Anpassende Immuntherapiemodelle können zur Bestätigung des Nutzens des Präparates gegen etablierte nicht-modifizierte Tumorzellen in vivo verwendet werden. Adaptive immunotherapy models can be used to confirm the usefulness of the drug against established non-modified tumor cells in vivo.
  • [0063] [0063]
    Die Erfindung schlägt auch vor, dass die Nukleinsäuremoleküle, die TAP-1 und TAP-2 oder nur TAP-1 kodieren, zur Verwendung bei der Erhöhung der Immunantwort auf ein Pathogen oder einen Tumor und zur Verwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere metastatischen Kleinzellenlungenkarzinomen, in rekombinante Virusvektor-Impfstoffe eingebracht werden können. The invention also proposes that the nucleic acid molecules encoding TAP-1 and TAP-2 or TAP-1 for use in increasing the immune response to a pathogen or tumor and for use in the treatment of cancer, in particular metastatic small cell lung carcinomas , in recombinant virus vector vaccines can be introduced. Man erwartet, dass diese Impfstoffe besonders geeignete Anwendung beispielsweise bei Säugetieren, einschließlich Menschen, finden, die keine Immunantwort auf bestimmte virale oder Tumor-Antigene hervorbringen können, wobei ihre HLA-Zusammenstellung keine angemessen Prozessierung und Präsentation des relevanten Antigenpeptids ermöglicht. It is expected that these vaccines particularly suitable application, for example, in mammals, including humans, can find that can produce an immune response to certain viral or tumor antigens, their HLA-compilation does not allow adequate processing and presentation of the relevant antigen peptide. Zum Beispiel zur Verwendung bei Personen oder Tumorzellen, denen Komponenten des Antigenpräsentationssystems fehlen, wie TAP-1, TAP-2 und Proteasomen-Komponenten, wird vorgeschlagen, dass die Nukleotidsequenzen, die TAP-1 und TAP-2 kodieren, getrennt verwendet werden können oder zusammen aufgenommen werden können, und zwar entweder unter der Kontrolle gesonderter Promotoren oder unter der Kontrolle des gleichen Promotors. For example, for use in persons or tumor cells to which components of the antigen presentation system is missing, such as TAP-1, TAP-2 and proteasome components, it is suggested that the nucleotide sequences encoding TAP-1 and TAP-2 may be used separately or can be added together, either under the control of separate promoters or under the control of the same promoter.
  • [0064] [0064]
    Impfstoffe aus rekombinantem Vaccinia-Virus können mit Verfahren des Standes der Technik konstruiert werden. Vaccines from recombinant vaccinia virus can be constructed by methods of the prior art. Der pJS5-Shuttler-Vektor, der zwei Early/Late-Verbindungpromotoren enthält, kann zur gleichzeitigen Expression von TAP und dem relevanten Antigen in einer infizierten Zelle verwendet werden. The pJS5-Shuttler vector which contains two early / late promoters connection can be used for simultaneous expression of TAP and the relevant antigen in an infected cell. Das oder die TAP-Gene können hinter einen Promotor kloniert werden, und das Protein oder Peptid kann hinter den zweiten Promotor kloniert werden, oder in ein zweites Vakzin. The TAP or the genes may be cloned behind one promoter and the protein or peptide can be cloned behind the second promoter, or in a second vaccine. TAP-1 kann hinter einen Promotor kloniert werden, und TAP-2 kann hinter den zweiten Promotor kloniert werden. TAP-1 may be cloned behind one promoter and TAP-2 may be cloned behind the second promoter. Die klonierten Gene können vom Thymidin-Kinasegen flankiert sein. The cloned genes may be flanked by the thymidine kinase gene. Der pJS-TAP-Antigenvektor kann in eine vacciniainfizierte Zelle transfiziert werden, so dass die homologe Rekombination zwischen der Thymidinkinasesequenz in Vaccinia und dem klonierten Shuttle-Vektor auftreten kann, was entweder ein rekombinanten Vacciniavirus ergibt, das TAP und das Antigen enthält, oder ein rekombinantes Vacciniavirus, das TAP-1 und TAP-2 enthält, was es ermöglicht, dass bestimmte Peptide transportiert und präsentiert werden können. The pJS-TAP-antigen vector can be transfected into a vacciniainfizierte cell, so that the homologous recombination between the Thymidinkinasesequenz in vaccinia and the cloned shuttle vector may occur, which either results in a recombinant vaccinia virus expressing TAP and the antigen comprises, or a recombinant vaccinia virus expressing TAP-1 and TAP-2 contains, thereby making it possible that certain peptides may be transported and presented.
  • [0065] [0065]
    Die vorliegende Beschreibung schlägt auch die Herstellung einer medizinischen Zusammensetzung vor, die die Abstoßung eines transplantierten Gewebes von einem Empfängertier hemmt, umfassend die Modifikation, Eliminierung oder Maskierung der Expression von TAP-1, TAP-2 oder TAP-1 und TAP-2 in Zellen des Gewebes, so dass die endogene Antigenprozessierung und Präsentation auf der Oberfläche der Zellen des Gewebes gehemmt wird, was eine T-Lymphozytenvermittelte Antwort in dem Tier bewirkt. The present specification also proposes the manufacture of a medical composition which inhibits rejection of a transplanted tissue from a recipient animal, comprising the modification, elimination or masking expression of TAP-1, TAP-2 or TAP-1 and TAP-2 in cells of the fabric so that the endogenous antigen processing and presentation is inhibited on the surface of cells of the tissue, resulting in a T-lymphocyte mediated response in said animal. Die Expression von TAP-1, TAP-2 oder TAP-1 und TAP-2 können mittels TAP-1, TAP-2 und/oder TAP-1 und TAP-2-Antisense modifiziert, eliminiert oder maskiert werden. Expression of TAP-1, TAP-2 or TAP-1 and TAP-2 can by means of TAP-1, TAP-2 and / or TAP-1 and TAP-2 modified antisense, eliminated or masked. MHC-Klasse-I-Moleküle können auch aus den Zellen des Transplantatgewebes eliminiert werden, und verkürzte Formen von TAP-1, TAP-2 und/oder TAP-1 und TAP-2 können zur Konkurrenz mit den funktionellen Transportern verwendet werden, was zur Abwärtsregulation der Expression von TAP-1 und/oder TAP-2 führt. MHC class I molecules may also be eliminated from the cells of the transplant tissue and truncated forms of TAP-1, TAP-2 and / or TAP-1 and TAP-2 may be used to compete with the functional transporters resulting in the leads down regulation of expression of TAP-1 and / or TAP-2.
  • [0066] [0066]
    Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen keinesfalls einschränkend sein. The following examples are illustrative only and are not meant to be limiting.
  • BEISPIELE EXAMPLES
  • [0067] [0067]
    Die folgenden Materialien und Methoden wurden bei den in den Beispielen 1 bis 8 aufgeführten Untersuchungen verwendet. The following materials and methods were used in the tests listed in the examples 1 to 8.
  • Tiere und Viren Animals and viruses
  • [0068] [0068]
    C57BI/6-Mäuse wurden in der Züchtungsabteilung der Universität von British Columbia gezüchtet. C57Bl / 6 mice were cultured in the culture department of the University of British Columbia. Die Mäuse waren 6 bis 12 Wochen alt und wurden gemäß den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care gehalten. The mice were 6 to 12 weeks old and were maintained in accordance with the guidelines of the Canadian Council on Animal Care. VSV wurde auf Vero-Zell-Einzelschichten gezüchtet. VSV was grown on vero cell monolayers. VSV und eine Human-β 2 m (hβ 2 m)-Vaccinia-Rekombinante wurden freundlicherweise von Dr. J. Yewdell zur Verfügung gestellt. VSV and a human β 2 m (hβ 2 m) vaccinia recombinants were kindly provided by Dr. J. Yewdell available.
  • Zelllinien und Antikörper Cell Lines and Antibodies
  • [0069] [0069]
    CMT.64-Zellen (H-2b) wurden freundlicherweise von Dr. LM Franks zur Verfügung gestellt (Franks, LM et al., 1976, Cancer, Res. 36: 1049). CMT.64 cells (H-2b) were kindly provided (Franks, LM et al 1976, Cancer Res 36..: 1049) by Dr. LM Franks available. RMA und RMA-S-Zellen wurden in DMEM gehalten, das mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 20 mM Hepes, 2 mM Glutamin, und Antibiotika supplementiert war. RMA and RMA-S cells were maintained in DMEM supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 20 mM Hepes, 2 mM glutamine, and antibiotics. Die verwendeten mAKs waren folgende: 142-23.3 anti H-2 K b , 28-11-5s anti H-2 D b (α1 + α2), 28-14-8s anti H-2 D b (α3) und BBM.1 gegen Human-β 2 m (Brodsky, FM et al., 1979, Eur. J. Immunol. 9: 536). The mAbs used were as follows: 142-23.3 anti-H-2K b, 28-11-5s anti-H-2 D b (α1 + α2), 28-14-8s anti-H-2 D b (α3) and BBM. 1 against human β 2 m (Brodsky, FM et al, 1979, Eur J Immunol. 9:.. 536). Ein Kaninchen-Antiserum gegen hβ 2 m (Bikoff, EK et al., 1991, Nature 354: 235) gegen Exon 8 von H-2K b (Williams, D. et al., 1989, J. Immunol. 142: 2796) und gegen Ratten-Proteasom (Brown, MG et al., 1991, Nature 353: 357) wurden ebenfalls verwendet. A rabbit antiserum to hβ 2 m (Bikoff, EK et al, 1991, Nature 354:. 235) against exon 8 of H-2Kb (Williams, D. et al, 1989, J. Immunol 142:.. 2796) and against rat proteasome (Brown, MG et al, 1991, Nature 353:. 357) were also used.
  • Transfektion Transfection
  • [0070] [0070]
    Die Transfektion von CMT.64-Zellen mit cDNA aus Ratten-TAP-1 in dem pHb-Apr-1-neo-Expressionsvektor (von Dr. G. Butcher zur Verfügung gestellt) wurde durch Lipofektion (Lipofectin, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) mit Hilfe von 10 μg DN erzielt A. Die Selektion erfolgte in 1 mg/ml G418 (Gibco BRL). Transfection of cells with CMT.64 cDNA from rat TAP-1 in the pHb-Apr-1-neo expression vector (Dr. G. Butcher provided) was by lipofection (Lipofectin, Gibco BRL, Gaithersburg, MD ) using 10 ug achieved DN A. Selection was in 1 mg / ml G418 (Gibco BRL). Positive Klone wurden durch Northern-Blotting selektiert und gescreent zur Expression des Ratten-TAP-1-Gens. Positive clones were selected and screened for expression of the rat TAP-1 gene by Northern blotting. Die mit einem repräsentativen Klon erhaltenen Ergebnisse sind beschrieben (siehe The results obtained with a representative clone are reported (see 9 9 ). ). Als negative Kontrollen wurden Klone, erhalten aus einer Vektor-DNA-Transfektion durch Northern-Blotting analysiert. As negative controls, clones obtained from a vector DNA transfection by Northern blotting. Die mit einer repräsentativen Klon erhaltenen Ergebnisse sind beschrieben (siehe The results obtained with a representative clone are reported (see 9 9 ). ).
  • Durchflusscytometrieanalyse Flow cytometry
  • [0071] [0071]
    Zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen wurde fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs-(FACS ® )-Analyse (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) verwendet. To determine the cell surface expression of MHC class I molecules fluorescence-activated cell sorting was (FACS ®) analysis (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) was used. RMA-, RMA-S-, und CMT.64-Zellen wurden mit oder ohne rekombinantes Maus-gamma-Interferon (IFN-γ) bei 150–300 Units/ml (Genzyme Cytokine Research Products) für 48 Std. behandelt. RMA, RMA-S, and CMT.64 cells were treated with or without recombinant mouse gamma-interferon (IFN-γ) at 150-300 units / ml (Genzyme Cytokine Research Products) for 48 h.. Die Zellen wurden gesammelt und über Nacht in Medium ohne FCS, mit VSV-N 52-59-Peptid (50 μM) und/oder hβ 2 m (2,5 μg) inkubiert. The cells were collected and incubated overnight in medium without FCS, with VSV-N 52-59 peptide (50 uM) and / or hβ 2 m (2.5 ug). Peptide wurden von der Peptidsyntheseabteilung der University of Victoria (Victoria, Block-Copolymer, Canada) erhalten. Peptides were obtained by peptide synthesis Department of University of Victoria (Victoria, block copolymer, Canada). Die Zellen wurden anschließend aus der Kultur entfernt, gewaschen und mit einer 1:50 Verdünnung von 142-23.3 Ascites oder 200 μl Zellkulturüberstand von 28-11-5s- und 28-14-8s-Zellen für 45 min auf Eis inkubiert. The cells were then removed from the culture, washed and incubated with a 1:50 dilution of 142-23.3 ascites, or 200 ul cell culture supernatant of 28-11-5s- and 28-14-8s cells for 45 min on ice. Nach zwei Waschschritten wurden die Zellen mit 100 μl einer 1:20 Verdünnung von Ziege-anti-Kaninchen- oder Ziege-anti-Maus-FITC-konjugiertem Zweitantikörper für weitere 45 min auf Eis inkubiert. After two washes, cells were incubated with 100 microliters of a 1:20 dilution of goat anti-rabbit or goat anti-mouse FITC-conjugated secondary antibody for an additional 45 min on ice. Die Proben wurden dann in Paraformaldehyd (1,5% in phosphatgepufferter Salzlösung) fixiert und auf einem FACScan ® -Zellsortierer mit dem FACScan ® -Programm (Becton Dickinson & Co.) fixiert. The samples were then fixed in paraformaldehyde (1.5% in phosphate buffered saline) and fixed on a FACScan ® -Zellsortierer with the FACScan ® program (Becton Dickinson & Co.). Die in der Tabelle 1 aufgeführten Werte sind lineare Ausdrücke, die den Durchschnitt von 5000 Zellen veranschaulichen. The values listed in Table 1 are linear expressions illustrate the average of 5000 cells. Der korrigierte Wert (minus dem Wert ohne Erstantikörper) ist aufgeführt. The corrected value (minus the value without primary antibody) is listed.
  • Zellmarkierung, Pulse-Chase-Experimente, Immunfällung, Isoelektrische Fokussierung und SDS-PAGE. Cell labeling, Pulse-Chase Experiments, Immunoprecipitation, Isoelectric Focusing and SDS-PAGE.
  • [0072] [0072]
    Die Zellen wurden in MEM-Medium ohne Methionin 1 Std. vor dem Markieren gewaschen und mit 150 μCi/ml 35 S-Methionin für 1 Std. oder wie angegeben markiert. The cells were cultured in MEM medium without methionine 1 hour. Washed prior to labeling and labeled with 150 uCi / ml 35 S-methionine for 1 hr., Or as indicated. Für die Pulse-Chase-Experimente wurden die Zellen 15 min markiert, und dann mit normalem Medium gechased, das einen Überschuss an kaltem Methionin enthielt. For the pulse-chase experiments, the cells were labeled for 15 minutes, and then chased with normal medium containing an excess of cold methionine. Markierte Zellen wurden mit 1 ml 20 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,6), das 0,12 M NaCl, 4 mM MgCl 2 und 1 % Nonidet P40, löslich gemacht, und Phenylsulfonylfluorid (PMSF, ein Protease-Inhibitor) wurde auf eine Endkonzentration von 20 μg/ml vor der Verwendung zugegeben. Labeled cells were washed with 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), containing 0.12 M NaCl, 4 mM MgCl 2 and 1% Nonidet P40, solubilized, and phenylsulfonyl fluoride (PMSF, a protease inhibitor) was added to a final concentration of 20 micrograms / ml before use. Nach 15 min auf Eis wurde teilchenförmiges Material durch Zentrifugation entfernt. After 15 min on ice, particulate material was removed by centrifugation. Der Überstand wurde zur Immunfällung von markierten Antigenen verwendet. The supernatant was used for immunoprecipitation of labeled antigens. Markierte löslich gemachte Antigene wurden zuerst mit 2 μl normalem Kaninchenserum für 45 min bei 4°C, gefolgt von 50 μl Protein-A-Sepharose (1:1 in Solubilisierungspuffer) für weitere 45 min bei 4°C vorgeklärt. Marked solubilized antigens were first with 2 ul of normal rabbit serum for 45 min at 4 ° C, followed by 50 ul of protein A-Sepharose (1: 1 in solubilization buffer) precleared for an additional 45 min at 4 ° C. Protein-A-Sepharose wurde durch eine schnelle Zentrifugation entfernt. Protein-A-Sepharose was removed by a quick centrifugation. Der vorgeklärte Überstand wurde mit dem geeigneten Antikörper oder Immunserum für 1 Std. bei 4°C umgesetzt. The pre-clarified supernatant was reacted with the appropriate antibodies or immune serum for 1 hr. At 4 ° C. 35 μl Protein-A-Segpharose wurde zugegeben, und die Inkubation für weitere 30 min fortgesetzt. 35 ul protein A-Segpharose was added and the incubation continued for a further 30 min. Nach der Zentrifugation wurden die Perlen zweimal mit 0,2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl pH-Wert 7,5, 0,15 M, NaCl und 2 mM EDTA, einmal mit 0,2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 0,5 M NaCl, 2 mM EDTA und schließlich mit 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5 gewaschen. After centrifugation, the beads were washed twice with 0.2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.15 M NaCl and 2 mM EDTA, once with 0.2% NP-40 in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 2 mM EDTA and finally with 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. Eindimensionale isolektrische Fokussierung erfolgte wie zuvor beschrieben in Celis, JE et al., (1990, Electrophoresis 11: 989). One-dimensional isoelectric focusing was carried out as previously described in Celis, JE, et al, (1990, Electrophoresis 11: 989).. SDS-PAGE erfolgte wie beschrieben in Kvist, S. et al. SDS-PAGE was carried out as described in Kvist, S. et al. (1982, Cell 29: 61). (1982, Cell 29: 61).
  • CTL-Antwort gegen VSV-infizierte, IFN-γ-induzierte Zellen CTL response to VSV-infected, IFN-γ-induced cells
  • [0073] [0073]
    RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen wurden mit oder ohne IFN-γ bei 200 Units pro ml für 48 Std. behandelt. RMA, RMA-S and CMT.64 cells were treated with or without IFN-γ at 200 units per ml for 48 hours.. Sie wurden anschließend 3x mit PBS gewaschen und mit VSV bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 5 min in 0,5 ml Medium für 1 Std. behandelt. They were subsequently washed 3x with PBS and incubated with VSV at a multiplicity of infection (MOI) of 5 min in 0.5 ml medium for 1 h. Treated. Die Kulturen wurden dann in insgesamt 3 ml Wachstumsmedium für weitere 4 bis 8 Std. (wie angegeben) inkubiert, so dass die Infektion weiterlaufen konnte. The cultures were then incubated in a total of 3 ml of growth medium for an additional 4 to 8 hours. (As indicated) were incubated, so that the infection could continue. Einzelne Zellsuspensionen wurden mit 100 μCi 51 Cr pro 10 6 Zellen für 2 Std. in RPMI 1640, supplementiert mit -L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin in Abwesenheit von fötalem Rinderserum (FBS) und Natriumbicarbonat, behandelt. Single cell suspensions were incubated with 100 uCi 51 Cr per 10 6 cells for 2 hrs. In RPMI 1640 supplemented with L-glutamine and penicillin / streptomycin in the absence of fetal bovine serum (FBS) and sodium bicarbonate, treated. Alternativ wurden die CMT.64-Zellen mit Vaccinia (V) und/oder Vaccinia-b2m (Vb2) bei einer MOI von 5 für 5 Std. infiziert, gefolgt von einer Superinfektion mit VSV (MOI, 5) für weitere 4 Std. Die Zellen wurden 3x gewaschen und anschließend bei 10 4 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen mit der Effektor-Population in Verhältnissen von 100 bis 12,5 inkubiert. Alternatively, CMT.64 cells with Vaccinia (V) and / or Vaccinia-b2m (Vb2) at an MOI of 5 for 5 hours were. Infected, followed by superinfection with VSV (MOI, 5) for a further 4 hours. The cells were washed 3x and subsequently incubated at 10 4 cells per well in 96-well plates with the effector population at ratios of 100 to 12.5. Scheininfizierte Zellen wurden als negative Kontrollen verwendet. Mock-infected cells were used as negative controls. Die Effektor-CTL-Population wurde erzeugt durch Immunisieren von C57bl/6-Mäusen mit VSV bei 5 × 10 6 – 1 × 10 7 TCID 50 in die Pfotenballen und Ohren. The effector CTL population was generated by immunizing C57BL / 6 mice with VSV at 5 × 10 6 - 1 × 10 7 TCID 50 in the footpad and ears. An Tag 5 nach der Immunisierung wurden die abführenden Lymphknoten (retropharyngeal und popliteal) geerntet und die Kulturen bei 4 × 10 6 Zellen pro ml in einem Gesamtvolumen von 5 ml in Platten mit 6 Vertiefungen gestartet. On day 5 post immunization the draining lymph nodes (retropharyngeal and popliteal) were harvested and the cultures started at 4 x 10 6 cells per ml in a total volume of 5 ml in 6-well plates. Das Kulturmedium bestand aus RPMI-1640, supplementiert mit 5 × 10 –5 M 2-Mercaptoethanol (ME), 10% hitzeinaktiviertem FBS, Natriumpyruvat, Penicillin, Streptomycin, L-Glutamin, HEPES, Natriumbicarbonat, und 50% NCTC-109. The culture medium consisted of RPMI-1640 supplemented with 5 x 10 -5 M 2-mercaptoethanol (ME), 10% heat inactivated FBS, sodium pyruvate, penicillin, streptomycin, L-glutamine, HEPES, sodium bicarbonate, and 50% NCTC-109th Die Kulturen wurden 3 Tage bei 37°C und 5% CO 2 in Abwesenheit von exogener Stimulation inkubiert. The cultures were incubated for 3 days at 37 ° C and 5% CO 2 in the absence of exogenous stimulation. Die 51 Cr-Freisetzung wurde durch einen Compugamma-Zähler (Model 1282 CS; LKB Instruments, Gaithersburg, MD) gemessen, und die spezifische Cr-Freisetzung berechnet als [(experimentell – Medienkontrolle)/(gesamt – Medienkontrolle)] × 100%. The 51 Cr release was determined by a Compugamma-counter (model 1282 CS; LKB Instruments, Gaithersburg, MD) was measured, and the specific Cr release calculated as [(experimental - media control) / (total - media control)] × 100%. Die spontane Freisetzung überschritt niemals 17% der Maximal-Freisetzung. The spontaneous release never exceeded 17% of maximum release.
  • RNA-Extraktion und Northern-Analyse RNA Extraction and Northern Analysis
  • [0074] [0074]
    Gesamt-Zell-RNA wurde aus Zelllinien mit Guanidiniumisothiocyanat (GITC) hergestellt. Total cellular RNA was prepared from cell lines using guanidinium isothiocyanate (GITC). Kurz gesagt wurden die Zellen in 4 M GITC lysiert, dann durch ein Cäsiumchloridkissen zentrifugiert (130000 × g für 16 Std. bei 23°C). Briefly, cells were lysed in 4 M GITC then centrifuged through a cesium chloride cushion (130000 × g for 16 hrs. At 23 ° C). Nach der Ethanolfällung wurde die gereinigte RNA in DEPC behandeltem H 2 O resuspendiert. After ethanol precipitation, the purified RNA was resuspended in DEPC treated H 2 O. 10 μg jeder Probe wurde auf ein Agarosegel, das 2,2 M Formaldehyd enthielt, aufgetragen und aufgetrennt. 10 ug of each sample was loaded onto an agarose gel containing 2.2 M formaldehyde gel and separated. Das Gel wurde auf Hybond N (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) geblottet und vor der Hybridisierung mit UV-Licht fixiert. The gel was blotted onto Hybond N (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) and fixed prior to hybridization with UV light. Die 32 P-markierten Sonden, die zur Hybridisierung verwendet wurden, waren wie folgt: MTP1 und MTP2 (TAP-1 bzw. 2, die freundlicherweise von Dr. Geoff Butcher zur Verfügung gestellt wurden), hergestellt durch Random-Priming, und ein für β-Aktin spezifisches Oligonukleotid, welches durch terminale Transferase markiert wurde. The 32 P-labeled probes were used for hybridization were as follows: MTP1 and MTP2 (TAP-1 and 2, which were kindly provided by Dr. Geoff Butcher available) prepared by random priming, and for β-actin-specific oligonucleotide was labeled by terminal transferase. Die Hybridisierung erfolgte bei 42°C in einem Puffer, der 0,4 M Na 2 HPO 4 , 50% Formamid und 7% SDS enthielt. Hybridization was performed at 42 ° C in a buffer containing 0.4 M Na 2 HPO 4, 50% formamide and 7% SDS. Mehrere Waschschritte wurden bei 42°C unter Bedingungen steigender Stringenz durchgeführt, und die Filter über Nacht einem X-OMAT AR-Film (KODAK) exponiert. Multiple washing steps were carried out at 42 ° C under conditions of increasing stringency and the filter exposed overnight to an X-OMAT AR film (Kodak).
  • BEISPIEL 1 EXAMPLE 1
  • Vergleich der Phänotypen von CMT.64- und RMA-S-Zellen Comparison of the phenotypes of CMT.64- and RMA-S-cells
  • [0075] [0075]
    Die Kleinzelllungenkarzinomlinie CMT.64 exprimierte und baute MHC-Klasse-I-Moleküle Befunden zufolge auf der Zelloberfläche nach der IFN-γ-Behandlung zusammen (Klar D. und Hammerling, 1989, EMBO J. 8: 475; Sibille, C. et al, 1992, Eur. J. Immunol. 22: 433; und Jefferies WA et al., 1993, J. Immunol. 151: 2974). The small cell lung carcinoma line CMT.64 expressed and built MHC class I molecules results indicated that on the cell surface after IFN-γ treatment together (Clear D. and Hammerling, 1989, EMBO J. 8: 475; Sibille, C. et al , 1992, Eur J. Immunol 22: 433; and Jefferies WA et al, 1993, J. Immunol 151:.... 2974).
  • [0076] [0076]
    Zum Verständnis der molekularen Defizienz bei der Antigenprozessierung von CMT.64-Zellen wurden die kontrastierenden Phänotypen der CMT.64-Zellen gegen RMA-S-Zellen analysiert. To understand the molecular deficiency in antigen processing of CMT.64 cells contrasting phenotypes of CMT.64 cells were analyzed against RMA-S cells. Die CTL-Erkennung von VSV-infizierten RMA-, RMA-S-, CMT.64- IFN-γ-induzierten oder uninduzierten Zellen wurde im Allgemeinen nach den im Methodikteil hier beschriebenen Verfahren untersucht. The CTL recognition of VSV-infected RMA, RMA-S, IFN-γ-induced CMT.64- or uninduced cells was examined in accordance with the methods described here in the methodology section. Insbesondere wurden die Zielzellen mit oder ohne IFN-γ für 48 Std. vor der Infektion mit VSV behandelt, und die Ergebnisse sind in der In particular, the target cells were treated with or without IFN-γ for 48 hours. Prior to infection with VSV and the results are shown in 1 1 gezeigt. shown. Tafel A in der Panel A in the 1 1 veranschaulicht ein repräsentatives Experiment mit RMA- und RMA-S-Zellen als Ziele, wohingegen Tafel B das äquivalente Experiment mit CMT.64-Zellen (abgekürzt: C) ist. illustrates a representative experiment using RMA and RMA-S cells as targets, whereas panel B is the equivalent experiment with CMT.64 cells (abbreviated: C). Sämtliche Zellen wurden mit VSV bei einer MOI von 10 für 4 Std. infiziert. All cells were infected with VSV at an MOI of 10 for 4 h.. IFN-γ-Behandlung ist in der IFN-γ treatment is 1 1 nach der Bezeichnung der Zelllinie mit einem +–Zeichen vermerkt. after the name of the cell line marked with a + sign. Die spontane Freisetzung überschritt 15% nicht. Spontaneous release did not exceed 15%.
  • [0077] [0077]
    VSV-infizierte RMA-S-Zellen werden so effizient wie die Wildtyp-RMA-Zellen mit oder ohne IFN-γ-Behandlung erkannt, im Vergleich zu VSV.64-Zellen, die nicht durch spezifische CTL erkannt werden, wenn nicht durch IFN-γ induziert ( VSV-infected RMA-S cells as efficiently as the wild-type RMA cells detected with or without IFN-γ treatment, compared to VSV.64 cells that are not recognized by specific CTL, if not by IFN γ induced ( 1B 1B ). ). Man beachte, dass RMA-S-, RMA- und CMT.64-Zellen gleichermaßen eine Infektion mit VSV erlaubten, wie durch die Zahl der infektiösen Partikel angezeigt, nach der Infektion, die durch einen TCID 50 -Assay gemessen wurde (Daten nicht gezeigt). It should be noted that RMA-S, RMA and CMT.64 cells infected with VSV equally permissible, as indicated by the number of infectious particles after infection measured by a TCID50 assay (data not shown ). Daher haben nicht-induzierte CMT.64-Zellen eine andere oder zusätzliche Defizienz zu dem funktionell defekten Peptid-Transportergen TAP-2 in RMA-S-Zellen. Therefore have uninduced CMT.64 cells have a different or additional deficiency to the functionally defective peptide transporter TAP-2 in RMA-S cells.
  • BEISPIEL 2 EXAMPLE 2
  • Wirkung von exogenem und endogenem Peptid auf die Phänotypen von CMT.64 und RMA-S-Zellen Effect of exogenous and endogenous peptide on the Phenotypes of CMT.64 and RMA-S-cells
  • [0078] [0078]
    Vorhergehende Experimente haben gezeigt, dass die Behandlung von mutierten Zellen mit exogenen Peptiden und/oder mit Human-β 2 m leere Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche stabilisieren kann (Townsend, A. et al. 1989, Nature 340: 443; Vitiello, A., et al., 1990, Science 250: 1423; und Ljunggren, H, -G. et al., 1990, Nature 346: 476). Previous experiments have demonstrated that treatment of mutant cells with exogenous peptides and / or with human β 2 m empty class I molecules can stabilize at the cell surface (Townsend, A. et al 1989, Nature 340:. 443; Vitiello , A., et al, 1990, Science 250:... 1423; and Ljunggren, H, G et al, 1990, Nature 346: 476). RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die uninduziert oder mit IFN-γ induziert waren, wurden über Nacht mit 50 μM exogenen Peptiden VSV-N 52-59 in Gegenwart oder in Abwesenheit von Human-β 2 m behandelt. RMA, RMA-S and CMT.64 cells, the uninduced or were induced with IFN-γ were treated overnight with 50 uM exogenous peptides VSV-N 52-59 in the presence or in the absence of human β 2 m , VSV-N-52-59-Peptide und β 2 m steigern synergistisch die Expression des K b -konformationsspezifischen Epitops, das durch 142.23.3-mAK (Tabelle 1) auf RMA- und RMA-S-Zellen erkannt wird. VSV-N 52-59 peptides and β 2 m synergistically increase the expression of K b -konformationsspezifischen epitope by 142.23.3 mAb (Table 1) is detected on RMA and RMA-S cells. VSV-N 52-59-Peptide beeinflussen spezifisch die Stabilität und die Konformation der K b -Moleküle und haben keine Wirkung auf D b -Moleküle. VSV-N 52-59 peptides specifically affect the stability and the conformation of the Kb molecules and have no effect on Db molecules. Human-β 2 m bindet an K b - und D b -Moleküle, was durch BBM.1 (Anti- Mensch-β 2 m-mAK) erfasst wird, und scheint die schweren Ketten zu stabilisieren, bevor sie an der Zelloberfläche zerfallen. Human β 2 m binds to K b - and D b molecules, which is detected by BBM.1 (anti-human β 2 m mAb), and appears to stabilize the heavy chains before they decay at the cell surface. Eine stabilisierende Wirkung wurde nicht nach der CMT.64-Behandlung mit Peptiden oder β 2 m allein beobachtet. A stabilizing effect was not observed after treatment with peptides CMT.64 or β 2 m alone. Zusätzliche Behandlung der CMT.64-Zellen mit IFN-γ war für eine starke Expression der K b - und D b -konformationsspezifischen Epitope auf der Zelloberfläche erforderlich (Tabelle 1). Additional treatment of CMT.64 cells with IFN-γ was a strong expression of K b - D b and -konformationsspezifischen epitopes on the cell surface is required (Table 1). Daher exprimieren CMT.64-Zellen viel geringere Mengen "leerer" Klasse-I-Moleküle an der Zelloberfläche als RMA-S-Zellen. Therefore, CMT.64 cells express much lower amounts of 'empty' class I molecules at the cell surface than RMA-S cells.
  • [0079] [0079]
    Vorhergehende Arbeiten haben gezeigt, dass die Anwesenheit von β 2 m und Peptiden in dem Lumen des ER notwendig ist für einen effizienten Zusammenbau und Zelloberflächenexpression der MHC-Klasse-I-Moleküle (Rock, K. et al., 1991, Cell 65: 611). Previous work has shown that the presence of β 2 m and peptides necessary in the lumen of the ER is for efficient assembly and cell surface expression of MHC class I molecules (rock, K. et al, 1991, Cell. 65: 611 ). Die The 2 2 zeigt die Menge von β 2 m, die in RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die IFN-γ induziert oder uninduziert waren, synthetisiert wurden. shows the amount of β 2 m, that were in RMA, RMA-S and CMT.64 cells that were IFN-γ induced or uninduced synthesized. Die Zellen wurden für 2 Std. mit 35 S-Methionin markiert, lysiert, mit einem Kaninchen-anit-hβ 2 m-Serum immungefällt, und durch SDS-PAGE analysiert. Cells were labeled for 2 h. With 35 S-methionine, lysed, immunoprecipitated with a rabbit anit-hβ 2 m serum and analyzed by SDS-PAGE. Die radioaktiven Proteine wurden nach 6 Std. Exposition gegenüber einem XAR-Film erfasst. The radioactive proteins were detected after 6 h. Exposure to XAR film. Es wurden CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt (+) oder nicht (–) behandelt waren, RMA- und RMA-S-Zellen verwendet ( There were CMT.64 cells treated with IFN-γ treated (+) or not (-) used were treated RMA and RMA-S cells ( 2 2 ). ). Die Wanderung des Molekulargewichtsmarkers ist auf der linken Seite von The migration of molecular weight marker is on the left side of 2 2 angegeben. specified.
  • [0080] [0080]
    Der The 2 2 zufolge exprimieren CMT.64-Zellen eine niedrige Menge endogenes β 2 m ( According CMT.64 cells express a low amount of endogenous β 2 m ( 2 2 , Spur 1). , Lane 1). IFN-γ- induzierte CMT.64.Zellen exprimieren eine viel höhere Menge β 2 m, die vergleichbar ist mit der Menge, die in RMA- und RMA-S-Zellen exprimiert wird ( IFN-γ- induced CMT.64.Zellen express a much higher amount of β 2 m, which is comparable to the amount expressed in RMA and RMA-S cells ( 2 2 , Spuren 2–4). , Lanes 2-4).
  • [0081] [0081]
    Zur Untersuchung der Wirkung von β 2 m in CMT.64-Zellen wurde ein rekombinantes Vaccinia-Virus zur Steigerung der Menge an endogenem β 2 m verwendet. To study the effect of β 2 m in CMT.64 cells, a recombinant vaccinia virus to increase the amount of endogenous β was used 2 m. Die Wirkung von β 2 m auf die CTL-Antwort gegen CMT.64-Zellen ist in der The effect of β 2 m on the CTL response against CMT.64 cells is in the 3 3 gezeigt. shown. Infizierte CMT.64-Zellen wurden mit Vaccinia- und Vaccinia-β 2 m-Rekombinante (V-Vb2), Vaccinia und VSV (V-VSV), oder Vaccinia-β 2 m und VSV (Vb2-VSV) ind FBS-freiem Medium (MOI 3) für bis zu weiteren 12 Std. superinfiziert. Infected cells were infected with vaccinia CMT.64 and vaccinia recombinant β 2 m (V-V b2), vaccinia and VSV (VSV-V), or vaccinia-β 2 m and VSV (VSV-V b2) ind FBS-free medium (MOI 3) for up to an additional 12 h. superinfected. Bei dem Einsatz in When used in 3 3 ist die synthetisierte Menge von β 2 m nach Immunfällung mit dem anti-hβ 2 m-Kaninchenserum gezeigt. is the synthesized amount of β 2 m after immunoprecipitation with the anti-hβ 2 m-rabbit serum is shown. CMT.64-Zellen, die mit dem Peptid VSV-N52-59 bei 500 pM für 2 Std. (CMT + p) behandelt wurden, wurden als positive Kontrolle verwendet, wohingegen scheinbehandelte CMT.64-Zellen (CMT+---) als negative Kontrolle verwendet wurden. CMT.64 cells treated with peptide VSV-N52-59 at 500 pM for 2 hours. (CMT + p) was used as positive control, whereas sham-treated CMT.64 cells (CMT + ---) as negative control were used. Die freigesetzte Radioaktivität ist der Durchschnitt von vierfachen Vertiefungen. The released radioactivity is the average of quadruplicate wells. Die spontane Freisetzung überschritt 16% nicht. Spontaneous release did not exceed 16%.
  • [0082] [0082]
    Wie in How to 3 3 gezeigt stellte eine Erhöhung der Menge von β 2 m, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus synthetisiert wurde, die CTL-Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen nicht wieder her. shown turned increasing the amount of β 2 m, which was synthesized with a recombinant vaccinia virus, the CTL recognition of VSV-infected CMT.64 cells does not restore. Daher induziert eine steigende Expression von β 2 m nicht die Präsentation von VSV-Peptiden im Zusammenhang der K b -Moleküle. Therefore, an increase in expression of β 2 m not induced the presentation of VSV-peptides in the context of K b molecules. Der CMT.64 antigenprozessierende Phänotyp wird nicht von der niedrigen Menge an endogenem β 2 m verursacht. The CMT.64 antigen-processing phenotype is not caused by the low amount of endogenous β 2 m.
  • BEISPIEL 3 EXAMPLE 3
  • Intrazellulärer Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle D b und K b Intracellular transport of MHC class I molecules D b and K b
  • [0083] [0083]
    Der Transport der K b - und D b -Moleküle wurde untersucht nach einer Pulse-Chase-Markierung von CMT.64-, RMA- und RMA-S-Zellen, und SDS-PAGE-Analyse des immungefällten Materials (für K b wurde 142.23.3-mAK verwendet, und für D b wurde 28-14-8s, ein α3-spezifischer mAK, verwendet). The transport of the K b - and D b molecules was examined after a pulse-chase labeling of CMT.64-, RMA and RMA-S cells and SDS-PAGE analysis of the immunoprecipitated material (for Kb was 142.23 .3 mAb used, and for D b was 28-14-8s, an α3-specific mAb used). Der intrazelluläre Transport der MHC-Klasse-I-Moleküle, D b und K b , ist in der Intracellular transport of MHC class I molecules, D b and K b, is in the 4 4 gezeigt. shown. Die Zellen wurden mit 35 S-Methionin markiert und in einem Überschuss von kaltem Methionin für die in Std. angegebenen Zeiten im Oberteil von The cells were labeled with 35 S-methionine and in an excess of cold methionine for the indicated in hours. Times in the upper part 4 4 gechased. chased. Löslich gemachte Antigene wurden mit 142.23.3-mAKs für K b oder 28-14-8s-mAKs für D b immungefällt. Solubilized antigens were immunoprecipitated with mAbs 142.23.3-K b or 28-14-8s-mAbs for D b. Die Behandlungen sind oben angegeben, und die Wanderung der Molekulargewichtsmarker ist auf der linken Seite von The treatments are given above, and the migration of molecular weight markers is on the left side of 15 15 angegeben. specified. Coimmunfällung der schweren Ketten (46 kD) und β 2 m (12kD) wird für alle Zellen beobachtet, außer für CMT.64-nicht-induzierte Zellen. Coimmunfällung of the heavy chains (46 kD) and β m 2 (12 kD) is observed for all cells except for CMT.64 uninduced cells. Radioaktive Proteine wurden nach 8 Tagen Exposition für RMA-S-Zellen und 4 Tagen für RMA- und CMT.64-Zellen einem XAR-Film ausgesetzt. Radioactive proteins were exposed after 8 days exposure for RMA-S cells and 4 days for RMA and CMT.64 cells to a XAR film.
  • [0084] [0084]
    Trotz einer ähnlichen Menge von K b -Molekülen, die in RMA- und RMA-S-Zellen synthetisiert wurden ( Despite a similar amount of K b molecules synthesized in RMA and RMA-S cells ( 4 4 , 0 Std. Chase-Dauer), werden nur geringe Menge K b zu einer höhermolekularen Form prozessiert, die das Ausmaß des Transport anzeigt, der für die Oberflächenexpression von K b in RMA-S-Zellen verantwortlich ist. , 0 hr. Chase period), only small amount of K b processed to a higher molecular weight form that indicates the extent of transport, which is responsible for the surface expression of K b in RMA-S cells. Die prozessierte Form ist gegenüber Endoglycosidase H-Spaltung resistent (Daten nicht gezeigt), was den Transport aus dem ER anzeigt. The processed form is resistant to endoglycosidase H digestion resistant (data not shown) indicating transport out of the ER. Die Beobachtung, dass viel mehr β 2 m mit K b -Molekülen als mit D b -Molekülen in RMA-S-Zellen immungefällt wird ( The observation that much more β 2 m with K b molecules than with D b molecules is immunoprecipitated in RMA-S cells ( 4 4 ) zeigt, dass der mAK 142.23.3 nur die zusammengebaute Form, schwere und leichte Ketten der K b -Moleküle erkennt, wohingegen der mAK 28-14-8s die α3-Region der D b -Moleküle erkennt. ) Shows that the mAb 142.23.3 only the assembled mold, heavy and light chains of the K b molecules recognize, whereas the mAb 28-14-8s recognizes the α3 region of the D b molecules. Die Anwesenheit eines funktionellen TAP-1-Proteins in RMA-S-Zellen (Yang, Y. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 11669) kann ausreichen, dass einige Peptide die ER-Membran durchqueren und eine kleine Anzahl K b -Moleküle binden, was es ihnen ermöglicht, zur Zelloberfläche zu wandern. The presence of a functional TAP-1 protein in RMA-S cells (Yang, Y. et al, 1992, J. Biol Chem 267:... 11669) may be sufficient that some peptides to cross the ER membrane and a small number K b molecules bond, allowing them to migrate to the cell surface. Peptide mit einer niedrigeren Affinität für K b -Moleküle können an Moleküle binden und dabei unterstützend wirken, dass diese zusammengebaut werden und zur Zelloberfläche wandern, wo sie dissoziieren. Peptides with a lower affinity for K b molecules can bind to molecules and play a supportive role that they are assembled and migrate to the cell surface, where they dissociate. Viel weniger reife prozessierte D b -Moleküle wurden in RMA-S-Zellen nach 4 Std. Chase erfasst ( Much less mature processed D b molecules were in RMA-S cells after 4 h. Chase acquired ( 4 4 ). ). Dies kann eine niedrigere Affinität von D b für β 2 m anzeigen und/oder, dass weniger Peptide für die D b -Bindung verfügbar sind. This may indicate a lower affinity of Db for β 2 m and / or that less peptides for D b bond are available. In RMA-Zellen wurden die K b -Moleküle innerhalb von 1 Std. prozessiert. In RMA cells, the K b molecules were processed within 1 h.. Zum Vergleich wurden die D b -Moleküle langsamer prozessiert (2 Std.) ( For comparison, the D b molecules were processed more slowly (2 hrs.) ( 4 4 ). ). Diese Ergebnisse stimmen mit der relativen Transportrate von K b und D b in RMA-S-Zellen überein. These results are consistent with the relative rate of transport of K b and D b match in RMA-S cells. Die IFN-γ-Behandlung steigert die Synthese der schweren Ketten, so dass mehr K b - und D b -Moleküle zur Zelloberfläche von RMA- und RMA-S-Zellen transportiert werden. The IFN-γ treatment increases the synthesis of the heavy chains, so that more K b - and D b molecules are transported to the cell surface of RMA and RMA-S cells. Die Transportrate von K b - und D b -Molekülen wurde nicht von der IFN-γ-Behandlung in RMA- und RMA-S-Zellen beeinträchtigt. The transport rate of K b - and D b molecules was not affected by the IFN-γ treatment in RMA and RMA-S cells. Keine K b -Moleküle wurden dagegen in CMT.64-Zellen mit dem 142.23.3-mAK erfasst. No K b molecules, however, were detected in CMT.64 cells with the 142.23.3 mAb.
  • BEISPIEL 4 EXAMPLE 4
  • Intrazellulärer Transport von freien und zusammengebauten Formen von K b - Molekülen in nicht induzierten und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen Intracellular transport of free and assembled forms of K b - molecules in non-induced IFN-γ-induced and CMT.64 cells
  • [0085] [0085]
    Wie vorstehend erläutert kann der 142.23.3-mAK die nicht zusammengebauten und peptidfreien schweren Ketten der K b -Moleküle nicht erkennen ( As explained above, the 142.23.3 mAb do not recognize unassembled and peptide-free heavy chains of the K b molecules ( 4 4 ). ). Dieser Angelegenheit wird nachgegangen, indem ein Kaninchenanti-Exon-8-Serum, das gegen ein konformationsunabhängiges Epitop gerichtet ist, das ein Peptid im cytoplasmatischen Schwanz der H-2K b -Moleküle erkennt (Williams, D. et al., 1989, J. Immunol. 142: 2796) zur Erfassung und Verfolgung der Prozessierung der K b -Moleküle in nicht induziertem oder IFN-γ-induzierten CMT.54-Zellen verwendet wurde. This matter will be followed by a rabbit anti-exon 8 serum directed against a konformationsunabhängiges epitope which is a peptide in the cytoplasmic tail of H-2Kb molecules recognizes (Williams, D. et al., 1989, J. Immunol 142:. 2796) was used to detect and track the processing of the K b molecules in non-induced IFN-γ-induced or CMT.54 cells.
  • [0086] [0086]
    Die Zellen wurden mit 35 S-Methionin markiert und in einem Überschuss von kaltem Methionin für die in Std. angegebenen Zeiten im Oberteil von The cells were labeled with 35 S-methionine and in an excess of cold methionine for the indicated in hours. Times in the upper part 5 5 gechased. chased. Löslich gemachte Antigene wurden mit einem Kaninchen-Anti-Exon-8-von H-2K b -Serum immungefällt, das den cytoplasmatischen Schwanz von freien und zusammengebauten K b -schweren Ketten wie hier beschrieben erkennt. Solubilized antigens were immunoprecipitated with a rabbit anti-exon-8-H-2K b of serum that recognizes the cytoplasmic tail of free and assembled K b severities chains as described herein. Die Behandlungen sind wie oben angegeben, und die Wanderung des Molekulargewichtsmarkers ist auf der linken Seite von The treatments are as given above, and the migration of the molecular weight marker is on the left side of 5 5 angegeben. specified. Radioaktive Proteine wurden nach 4 Tagen Exposition gegenüber RPN-30-Film (Amersham, Corp.) erfasst. Radioactive proteins were detected after 4 days exposure to RPN-30 film (Amersham Corp.).
  • [0087] [0087]
    In nicht induzierten CMT.64-Zellen wurden K b -Moleküle früh nach der Synthese erfasst ( In uninduced cells CMT.64 K b molecules were detected early after synthesis ( 5 5 , 0h, 0,5h und 1 h Chase-Zeit), sie waren jedoch instabil und zum Großteil nach 8 Std. Chase abgebaut, wobei sehr wenig Moleküle zu einem höheren Molekulargewicht prozessiert wurden ( , 0h, 0.5h and 1 broken h chase time), but they were unstable and mostly after 8 hours. Chase, with very few molecules were processed to a higher molecular weight ( 5 5 , . 8 8 h. Chase-Dauer) prozessiert. h. litigated chase period). In induzierten Zellen wurden K b -Moleküle in höheren Mengen synthetisiert, und es wurde ein größerer Anteil der Moleküle zu einem höheren Molekulargewicht prozessiert ( In induced cells, Kb molecules were synthesized in higher amounts, and there was a greater proportion of the molecules to a higher molecular weight processed ( 5 5 ). ). Die Abnahme der Materialmenge, die durch dieses Antiserum immungefällt wird, während des Chases konnte nicht erklärt werden. The decrease in the amount of material that is immunoprecipitated by this antiserum, while the chase could not be explained. Ein Verlust oder ein Abbau des Epitops, das durch das Antiserum erkannt wird, während des Transports, ist möglich. A loss or degradation of the epitope that is recognized by the anti-serum during transport is possible. Zudem werden D b -Moleküle ebenfalls synthetisiert und werden dann abgebaut oder denaturiert ( In addition, D b molecules also synthesized and then degraded or denatured ( 4 4 ). ). Bei nicht induzierten CMT.64-Zellen wurden keine prozessierten D b -Moleküle erfasst, selbst nach 4 Std. Chase. In uninduced cells CMT.64 not processed D b molecules were detected even after 4 hours. Chase. Nur die Behandlung mit IFN-γ führt zu einer höheren Expression, gesteigertem Transport und einer gesteigerten Transportrate von K b - und D b -Molekülen in CMT.64-Zellen. Only treatment with IFN-γ results in higher expression, increased transport and increased transport rate of K b - and D b molecules in CMT.64 cells. Somit wurden Komponenten, die für den Zusammenbau und den Transport von K b -schwere Ketten und β 2 m nötig sind, durch IFN-γ in CMT.64-Zellen induziert, wohingegen eine ähnliche Induktion den Transport von D b und K b in RMA- oder RMA-S-Zellen nicht signifikant veränderte. Thus, components that are 2 m required for the assembly and transport of K b and β chains severity induced by IFN-γ in CMT.64 cells, whereas a similar induction of the transport of D b and K b in RMA - or RMA-S cells do not significantly altered. Dies zeigt, dass CMT.64-Zellen wahrscheinlich in Komponenten defizient sind, die für den MHC-Klasse-I-Zusammenbau nötig sind, welches sich von dem TAP-Defekt in RMA-S-Zellen unterscheidet. This indicates that CMT.64 cells are likely deficient in components necessary for MHC class I assembly which differ from the TAP-defect in RMA-S cells.
  • BEISPIEL 5 EXAMPLE 5
  • VSV-N 52-59 Peptid-Reaktion bei der CTL-Erkennung VSV-N 52-59 peptide response in CTL recognition
  • [0088] [0088]
    Zur Untersuchung der Funktion der MHC-Klasse-I-Moleküle wurde die CTL-Erkennung von CMT.64-Zellen, die IFN-γ-induziert oder nicht induziert waren, und von RMA-S-Zellen, die mit exogenen Peptiden behandelt waren, untersucht. To investigate the MHC class I molecules function the CTL recognition of CMT.64 cells that were IFN-γ-induced or not induced was, and RMA-S cells treated with exogenous peptides, examined. CMT.64-Zellen (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) und RMA-S-Zellen (RMA-S) wurden mit Peptid N52-59 bei den in CMT.64 cells (CMT), CMT.64 + IFN-γ (CMT + IFN-γ) and RMA-S cells (RMA-S) were treated with peptide N52-59 at the in 6 6 angegebenen Konzentrationen behandelt. treated indicated concentrations. Die durch spezifische CTL-Erkennung und Lyse freigesetzte Radioaktivität wurde gemessen und dargestellt, wie in den vorstehend beschriebenen Materialien und Methoden angegeben. The released by specific CTL recognition and lysis radioactivity was measured and represented as indicated in materials and methods described above. Die in The in 6 6 gezeigte freigesetzte Radioaktivität ist der Durchschnitt von vierfachen Vertiefungen. released radioactivity shown is the average of quadruplicate wells. Die spontane Freisetzung lag nicht über 13%. Spontaneous release did not exceed 13%.
  • [0089] [0089]
    In einer dosisabhängigen Weise waren die RMA-S- und IFN-γ-behandelten Zellen 10000 mal empfindlicher als CMT.64-Zellen gegenüber dem Abtöten durch spezifische CTL nach 2 Std. Behandlung mit exogenen Peptiden ( In a dose dependent manner, treatment of the RMA-S and IFN-γ treated cells were 10,000 times more sensitive than CMT.64 cells to killing by specific CTL after 2 hours. With exogenous peptides ( 6 6 ). ). Diese Ergebnisse bieten einen Beweis für die niedrige Expression von Peptid empfangenden MHC-Klasse-I-Molekülen auf der Oberfläche von nicht induzierten CMT.64-Zellen. These results provide evidence for the low expression of peptide receiving MHC class I molecules on the surface of uninduced CMT.64 cells. Bei der Dosisantwort von RMA-S-Zellen wurde ein Maximum von 15000 Peptidmolekülen pro Zelle benötigt, um ein 50%iges Abtöten durch spezifische CTL zu erzielen, wohingegen eine niedrigere Schwelle von 150 Molekülen pro Zelle zur Freisetzung von 5 bis 10% 51 Cr führte. At the dose response of RMA-S cells, a maximum of 15,000 peptide molecules per cell were needed to achieve 50% killing by specific CTL, whereas a lower threshold of 150 molecules per cell to release of 5 to 10% 51 Cr led , Diese Daten können durch eine hohe Menge empfangender Moleküle oder eine hohe Affinität der MHC-Klasse-I-Moleküle für das Peptid auf der Oberfläche von RMA-S- und IFN-γ-induzierten CMT.64-Zellen erklärt werden. These data can be explained by a high amount of receiving molecules or high affinity of the MHC class I molecules for the peptide on the surface of RMA-S and IFN-γ-induced CMT.64 cells. Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Assays, wobei es keine exogenen β 2 m gibt, stabilisieren die exogen zugegebenen Peptide wahrscheinlich die leeren K b -Moleküle, die an der Zelloberfläche der RMA-S ankommen, bevor sie aus β 2 m dissoziieren (Rock, K. et al., 1991, Cell 65: 611 und Jefferies W. et al., siehe oben, 1993). Under the conditions of the assay according to the invention, in which there are no exogenous β 2 m, the exogenously added peptides stabilize probably the empty K b molecules arriving at the cell surface of RMA-S before they dissociate from β 2 m (rock, K et al., 1991, Cell. 65: 611 and Jefferies W. et al, supra, 1993).. Die niedrige Menge des leeren K b , das in uninduzierten CMT.64-Zellen transportiert wird, erläutert den Unterschied der Sensibilisierung gegenüber exogenen Peptiden. The low amount of empty K b, which is transported in uninduced cells CMT.64 explains the difference in sensitization to exogenous peptides.
  • BEISPIEL 6 EXAMPLE 6
  • Expression von TAP-1- und TAP-2-Genen in CMT.64- und RMA-S-Zellen Expression of TAP-1 and TAP-2 genes in CMT.64- and RMA-S-cells
  • [0090] [0090]
    Die in den The in 2 2 bis to 6 6 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass trotz seiner niedrigen Expression β 2 m allein nicht für das Fehlen der Antigenpräsentation in CMT.64-Zellen verantwortlich ist. Show results shown that, despite its low expression of β 2 m alone is not responsible for the absence of antigen presentation in CMT.64 cells. Zudem werden die K b - und D b -Moleküle in diesen Zellen synthetisiert, jedoch werden sehr wenige zur Zelloberfläche transportiert, wo sie exogen zugefügte Peptide binden. In addition, the K b - and D b molecules synthesized in these cells, but very few are transported to the cell surface, where they bind exogenously added peptides. Neben den schweren und leichten Ketten sind Peptide für einen effizienten Zusammenbau der MHC-Klasse-I-Moleküle im ER notwendig (Spies, T. et al., 1990, Nature 348: 744; Monaco, JJ et al., 1990, Science 250: 1723; Spies, T. und DeMars, R., 1991, Nature 351: 323 und; Townsend, A. et al., 1989, Nature 340: 443). In addition to the heavy and light chains are peptides for efficient assembly of MHC class I molecules in the ER is necessary (Spies, T. et al, 1990, Nature 348:.. 744; Monaco, JJ et al, 1990, Science 250 : 1723; Spies, T. and DeMars, R., 1991, Nature 351: 323 and; Townsend, A. et al, 1989, Nature 340:. 443). Die Möglichkeit, dass das Fehlen der Komponenten, die für die Erzeugung und den Transport dieser Peptide im ER verantwortlich sind, für den CMT.64-Phänotyp verantwortlich ist, wurde untersucht. The possibility that the absence of components that are responsible for the generation and transport of these peptides in the ER, is responsible for the CMT.64 phenotype was investigated.
  • [0091] [0091]
    Ein putativer Peptidtransporter, der mutmaßlich aus einem Heterodimer von zwei halben Transportern des ABC-Typs, den sogenannten TAP-1 und TAP-2, besteht, wurde bei der Translokation der Peptide in das ER für den MHC-Klasse-I-Zusammenbau in Zusammenhang gebracht (Kelly, A. et al., 1992, Nature 355: 641 und Powis, SH et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1463). A putative peptide transporter, which is considered a heterodimer of two half-transporters of the ABC type, the so-called TAP-1 and TAP-2, there was in the translocation of peptides into the ER for MHC class I assembly in context put (Kelly, A. et al, 1992, Nature 355:.... 641 and Powis, SH et al, 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:.. 1463). Zur Charakterisierung des Unterschieds der Phänotypen zwischen RMA-S- und CMT.64-Zellen wurde die Expression von TAP-1- und TAP-2-Genen in diesen Zellen durch Northern-Blot-Analyse der Gesamt-Zell-RNA aus RMA-, RMA-S-, CMT.64-Zellen, die IFN-γ-induziert und nicht induziert waren ( To characterize the difference of phenotypes between RMA-S and CMT.64 cells, the expression of TAP-1 and TAP-2 genes in these cells was determined by Northern blot analysis of total cellular RNA from RMA, RMA-S, CMT.64 cells were IFN-γ-induced and non-induced ( 7 7 ), untersucht. ) Was investigated. 10 μg Cytoplasma-RNA aus CMT.64-, RMA- und RMA-S-Zellen, IFN-γ- induziert (+) oder nicht induziert (–), wurden analysiert, und die Ergebnisse sind in der 10 ug cytoplasmic RNA from CMT.64-, RMA and RMA-S cells IFN-γ- induced (+) or not induced (-) were analyzed and the results are shown in 7 7 gezeigt. shown. TAP-1-, TAP-2- und β-Aktin-Sonden wurden mit der Membran hybridisiert. TAP-1, TAP-2 and β-actin probes were hybridized with the membrane. Die an spezifische RNA-Sequenzen gebundene Radioaktivität wurde nach Exposition der Membran über Nacht gegenüber einem XAR-Film erfasst. Bound to specific RNA sequences was detected after exposure to radioactivity of membrane overnight against a XAR film.
  • [0092] [0092]
    In In 7 7 zeigt die Northern-Blot-Analyse, dass nicht induzierte CMT.64-Zellen keine erfassbare Menge an TAP-1- und TAP-2-mRNA exprimierte, und dass die Menge dieser mRNAs nach der IFN-γ-Behandlung dieser Zellen stark erhöht war. shows the Northern blot analysis shows that uninduced CMT.64 cells did not express detectable amount of TAP-1 and TAP-2 mRNA and that the amount of these mRNAs was highly increased after IFN-γ treatment of these cells , Zudem zeigt die Also shows the 7 7 , dass kein größerer Unterschied zwischen TAP-1- und TAP-2-Genexpression in RMA-S- und RMA-Zellen bestand, und dass die IFN-γ-Behandlung nur marginal die TAP-1- und -2-Expression in diesen Zellen beeinflusste. That there is no greater difference between TAP-1 and TAP-2 gene expression in RMA-S and RMA cells existed, and that the IFN-γ treatment only marginally the TAP-1 and -2 expression in these cells influenced. Die Menge der Aktin-mRNA gibt ein Anzeichen der nahezu gleichen Menge mRNA, die auf das Gel zum Northern-Blotting aufgetragen ist. The amount of actin mRNA gives an indication of the nearly same amount of mRNA loaded on the gel for Northern blotting. Die IFN-γ-Induzierbarkeit von TAP-1 und -2 wurde zuvor in Mausgeweben aufgezeigt (Gaskin, HR et al., 1992, Science 256: 1826), jedoch wurde dies nicht in RMA-, RMA-S- oder CMT.64-Zellen vor dieser Studie untersucht. The IFN-γ inducibility of TAP-1 and -2 was previously demonstrated in mouse tissues (Gaskin, HR et al, 1992, Science 256:. 1826), but this was not in the RMA, RMA-S or CMT.64 cells studied prior to this study. Die hier aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die TAP-1- und TAP-2-Gene in CMT.64-Zellen mit IFN-γ induzierbar sind und zu einem geringerem Maße in RMA- und RMA-S-Zellen. The results shown here, that the TAP-1 and TAP-2 genes are inducible in CMT.64 cells with IFN-γ and to a lesser degree in RMA and RMA-S cells. Das Fehlen der TAP-1- und TAP-2-mRNA-Expression in CMT.64-Zellen verursacht wahrscheinlich ein Fehlen der Antigenpeptide im ER für die Bindung an MHC-Klasse-I-Moleküle und deren Zusammenbau. The lack of TAP-1 and TAP-2 mRNA expression in CMT.64 cells likely causes a lack of antigenic peptides in the ER for binding to MHC class I molecules and their assembly. Dies führt zu einer Nicht-Erkennung der VSV-infizierten CMT.64-Zellen. This leads to a non-recognition of VSV-infected CMT.64 cells. RMA-S-Zellen exprimieren dagegen ein funktionelles TAP-1-Molekül, das Peptide bei der Durchquerung der ER-Membran unterstützen kann. Contrast, RMA-S cells express a functional TAP-1 molecule that may aid peptides while crossing the ER membrane. Dies würde den Zusammenbau und den Transport der MHC-Klasse-I in RMA-S-Zellen und ihre CTL-Erkennung nach der VSV-Infektion erklären. This would explain the assembly and transport of MHC class I in RMA-S cells and their CTL recognition after VSV infection. Das Fehlen von TAP-1 und TAP-2 in nicht induzierten CMT.64-Zellen kann einer der Faktoren sein, die für den Phänotyp der CMT.64-Zellen verantwortlich ist, der durch die Bildung instabiler und ineffizient transportierter MHC-Klasse-I-Komplexe gekennzeichnet ist. The lack of TAP-1 and TAP-2 in uninduced CMT.64 cells may be one of the factors responsible for the phenotype of CMT.64 cells, which through the formation of unstable and inefficiently transported MHC class I complexes is characterized.
  • BEISPIEL 7 EXAMPLE 7
  • Proteasomen-Komponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen die mit IFN-γ induziert waren oder nicht Proteasome components from RMA, RMA-S and CMT.64 cells were induced with IFN-γ or not
  • [0093] [0093]
    Vor dem Schluss, dass die TAP-Defizienzen die wahrscheinlichen oder einzigen Defekte in CMT.64-Zellen sind, wurde das Vorhandensein von Proteasomen-Komponenten in diesen Zellen untersucht. Prior to the conclusion that TAP deficiencies are the likely or only defects in CMT.64 cells, the presence of proteasome components in these cells was examined. Virale Peptide werden wahrscheinlich im Cytoplasma durch das Proteasom erzeugt (Ortiz-Navarette, V. et al., Nature 353: 662, 1991; Brown, MG, et al., Nature 353: 355, 1991; Glynne, R. et al., Nature 353: 357, 1991; Martinez, CK und JJ Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly A. et al., Nature 353: 667, 1991: Yang Y. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 4928, 1992; und Goldberg, AL und KL Rock, Nature 357: 375, 1992) vor dem Durchqueren der ER-Membran. Viral peptides are likely to be generated in the cytoplasm by the proteasome (Ortiz-Navarette, V. et al, Nature 353: 662, 1991; Brown, MG, et al, Nature 353:. 355, 1991; Glynne, R. et al., , Nature 353: 357, 1991; Martinez, CK and JJ Monaco, Nature 353: 664, 1991; Kelly, A., et al, Nature 353: 667, 1991: Y. Yang et al, Proc Natl Acad Sci..... USA 89: 4928, 1992, and Goldberg, AL and KL rock, Nature 357: 375, 1992) prior to passing the ER membrane. Die Proteasomen-Komponenten sind wahrscheinlich Schlüsselverbindungen bei der Antigenprozessierung, die in diesen Zellen fehlen könnte. The proteasome components are likely key compounds in antigen processing which could be absent in these cells. Ein Kaninchen-anti-Ratte-Proteasom-Serum wurde verwendet, das das Maus-Proteasom erkennt. A rabbit anti-rat proteasome serum was used which recognizes the mouse proteasome. Nach der Immunfällung der Proteasomen können die verschiedenen niedermolekularen Komponent-Polypeptide (LMP), die in diesen Mauszellen produziert werden, durch zweidimensionale Gelelektrophorese analysiert werden. After immunoprecipitation of the proteasomes, the different low molecular weight Component polypeptides (LMP) produced in these mouse cells can be analyzed by two-dimensional gel electrophoresis.
  • [0094] [0094]
    Zweidimensionale Gelanalyse der Proteasomenkomponenten aus RMA-, RMA-S- und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ induziert oder nicht induziert waren, sind in der Two-dimensional gel analysis of Proteasomenkomponenten from RMA, RMA-S and CMT.64 cells were induced with IFN-γ induced or not, are 8 8 gezeigt. shown. Die Zellen wurden für 2 Std. mit 35 S-Methionin markiert. The cells were labeled for 2 h. With 35 S-methionine. Solubilisierte Antigene wurden mit einem Kaninchen-anti-Ratte-Proteasom-Serum immungefällt und nach dem isoelektrischen Focussieren in einer ersten Dimension und 10–15% SDS-PAGE in einer zweiten Dimension analysiert. Solubilized antigens were immunoprecipitated with a rabbit anti-rat proteasome serum and analyzed after isoelectric stayed focused in a first dimension and 10-15% SDS-PAGE in a second dimension. Die radioaktiven Proteine wurden nach 10 Tagen Exposition gegenüber einem XAR-Film erfasst. The radioactive proteins were detected after 10 days of exposure to XAR film. Die Behandlung der Zellen ist oben in The treatment of the cells is at the top of 8 8 angegeben. specified. Die saure Seite des Gels ist auf der rechten Seite und die basische Seite ist auf der linken Seite des Gels. The acidic side of the gel is on the right side and the basic side is on the left side of the gel. Die Wanderung der Molekulargewichtmarker ist auf der linken Seite des Gels angegeben. The migration of molecular weight markers is indicated on the left side of the gel. Die fehlenden Proteine sind durch einen Pfeil angezeigt und nummeriert ( The missing proteins are indicated by an arrow and numbered ( 8 8 ). ). Die Proteine mit den Nummern 1 und 7 entsprechen LMP-7 bzw. LMP-2. The proteins with the numbers 1 and 7 correspond LMP-7 and LMP-2.
  • [0095] [0095]
    Die zweidimensionale Gelanalyse der Immunfällungen ergab, dass die Hauptkomponenten der Proteasomen nicht durch eine IFN-γ-Behandlung von CMT.64-Zellen beeinträchtigt werden, aber dass sieben Komponenten, wie ua LMP-2 und -7 in nicht induzierten CMT.64-Zellen fehlten. The two-dimensional gel analysis of immunoprecipitations revealed that the major components of the proteasome are not affected by IFN-γ treatment of CMT.64 cells but that seven components, such as, inter alia, LMP-2 and -7 in uninduced CMT.64 cells were missing. Gemäß den Ergebnissen anderer Gruppen (Früh, K. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 22131) entsprechen die Proteine mit den Nummern 1 und 7 in According to the results of other groups (early, K. et al, 1992, J. Biol Chem 267:... 22131), the proteins with the numbers 1 and 7 correspond to 8 8 LMP-7 bzw. LMP-2. LMP-7 and LMP-2. LMP-2, LMP-7 und fünf andere Komponenten des Proteasoms wurden durch IFN-γ in RMA- und RMA-S-Zellen leicht hochreguliert, und induzierten von einem Zustand einer nicht erfassbaren Expression auf eine stärker erfassbare Menge der Expression in IFN-γ-behandelten CMT.64-Zellen ( LMP-2, LMP-7 and five other components of the proteasome were slightly upregulated by IFN-γ in RMA and RMA-S cells, and induced a state of a non-detectable expression in a more detectable amount of expression in IFN-γ -treated CMT.64 cells ( 8 8 ). ). LMP-7 ( LMP-7 ( 8 8 , . 1 1 ) wird in CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, besonders stark induziert. ) Is particularly strongly induced in CMT.64 cells treated with IFN-γ. Diese Ergebnisse stehen den Ergebnissen anderer Gruppen entgegen, die nahe legten, dass CMT.64 einen niedrigen Spiegel sämtlicher Proteasomen-Komponenten exprimieren (Ortiz-Navarette, V. et al., 1991, Nature 353: 662), und diese neuen Ergebnisse zeigen, dass diese induzierten Proteasomenkomponenten die Aktivität des Proteasoms beeinträchtigen und die Erzeug der VSV-N-Peptide in induzierten CMT.64-Zellen ermöglichen. These results are contrary to the results of other groups, which suggested that CMT.64 a low level of all proteasome components express (Ortiz-Navarette, V. et al, 1991, Nature 353:. 662), and show these new results, that these induced Proteasomenkomponenten affect the activity of the proteasome and allow the prod of the VSV-N peptides in induced CMT.64 cells. Neuere Daten (Arnold, D. et al., 1992, Nature: 171, und Momburg, F. et al., 1992, Nature 360: 174) legen nahe, dass LMP-2 und -7 für eine Influenza-Virus-Antigenpräsentation in Zellmutanten, die mit den TAP-1- und TAP-2-Genen transfiziert wurden, nicht nötig sind. Recent data (Arnold, D. et al, 1992, Nature. 171, and Momburg, F. et al, 1992, Nature 360:. 174) suggest that LMP-2 and -7 for an influenza virus antigen presentation , are not necessary in cell mutants, which were transfected with the TAP-1 and TAP-2 genes.
  • [0096] [0096]
    Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass IFN-γ-Behandlung zusätzlich zur Induktion der Transkription von TAP-1- und TAP-2-Genen auch die Synthese von sieben Komponenten der Proteasomen hochreguliert, einschließlich LMP-2 und -7 Andere beschreiben, dass Komponenten neben LMP-2 und LMP-7 in HeLa-Zell-Proteasomen durch IFN-γ-Behandlung hochreguliert werden (Yang, Y et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4928, 1992; und Früh, K. et al., J. Biol. Chem. 267: 22131, 1992). The above results show that IFN-γ treatment in addition to inducing transcription of TAP-1 and TAP-2 genes also upregulates the synthesis of seven components of the proteasomes, including LMP-2 and -7 Other describe that components in addition to LMP-2 and LMP-7 are upregulated in HeLa cell proteasomes by IFN-γ treatment (Yang Y et al, Proc Natl Acad Sci USA 89:..... 4928, 1992; and breakfast, K. et al, J. Biol Chem 267:... 22131, 1992). Da diese Zellen jedoch funktionell Wildtyp sind, wurde der funktionellen Konsequenz dieser Regulation nicht nachgegangen. However, since these cells are functionally wild-type, the functional consequence of this regulation has not been investigated. Da LMP-2 und LMP-7 darüber hinaus zuerst als Vorstufenproteine synthetisiert werden, die zu kleineren Produkten gespalten werden (Früh, K. et al., J. Biol. Chem. 267: 22131, 1992), können einige der 5 zusätzlichen Proteine, die bei uninduzierten CMT.64-Zellen fehlen, die Vorstufenproteine von LMP-2 und LMP-7 sein. As LMP-2 and LMP-7 are first synthesized as a precursor addition, proteins that are cleaved into smaller products (Früh, K. et al, J. Biol Chem 267:... 22131, 1992), some of the five additional proteins can which are absent in uninduced cells CMT.64 be the precursor proteins of LMP-2 and LMP-7.
  • BEISPIEL 8 EXAMPLE 8
  • Erkennung von VSV-infizierten TAP-1-positiven CMT.64-Zellen Recognition of VSV infected TAP-1 positive CMT.64 cells
  • [0097] [0097]
    Die Erwägung der angereicherten Daten, bezüglich der Antigenprozessierung in RMA-S- und CMT.64-Zellen führt zu der Behauptung, dass ein funktionelles TAP-1-Protein-Homodimer allein den Transport des VSV-N 52-59 Peptids aus dem Cytosol in das ER-Lumen erleichtert, wo die Bindung an die schwere Ketten erfolgt. The consideration of the enriched data with respect to the antigen in RMA-S and CMT.64 cells leads to the assertion that a functional TAP-1 protein homodimer alone the transport of VSV-N 52-59 peptide from the cytosol into facilitates the ER lumen, where they are binding to the heavy chains. Eine alternative Erklärung ist, dass dieses Peptid keinen Transporter für die Translokation über die ER-Membran benötigt, jedoch nicht in den CMT.64-Zellen erzeugt wird. An alternative explanation is that this peptide no transporter translocation across the ER membrane requires, however, is not produced in the CMT.64 cells. Zur eindeutigeren Definition des Defekts, der die Erkennung von VSV-infizierten CMT.64-Zellen durch spezifische CTL beeinflusst, wurde das Ratten-Tap-1-Gen in die CMT-64-Zellen eingebracht. For clearer definition of the defect affecting the recognition of VSV-infected CMT.64 cells by specific CTL, the rat-tap 1 gene was introduced into the CMT-64 cells.
  • [0098] [0098]
    CMT.64 (CMT), CMT.64, das mit TAP-1 transfiziert wurde (CMT TAP 1) und CMT.64-Zellen, die nur mit dem Vektor (CMT Vec) transfiziert wurden, wurden mit oder ohne VSV für 8 Std. bei einer MOI von 5 infiziert, oder mit N52-59-Peptid für 2 Std. bei 500 pM (50% Dosisantowrt) behandelt. CMT.64 (CMT), CMT.64, was transfected with TAP-1 (CMT TAP 1), and CMT.64 cells transfected with the vector only (CMT Vec) were treated with or without VSV for 8 hr infected. at a MOI of 5, or with N52-59 peptide for 2 hr. at 500 pM (50% Dosisantowrt) treated. Die spontane Freisetzung überschritt 12% nicht. Spontaneous release did not exceed 12%. Die The 9 9 zeigt, dass VSV-Infizierte TAP-1-positive CMT.64-Zellen durch spezifische CTL erkannt wurden. shows that VSV infected TAP-1 positive CMT.64 cells were recognized by specific CTL. Dieses Ergebnis erläutert den RMA-S-Phänotyp und seine offensichtliche "Undichtigkeit" in Bezug auf die VSV-Präsentation (Esquivel, F. et al., J. Exp. Med. 175: 163, 1992; Hosken, NA und MJ Bevan, J. Exp. Med. 175: 719, 1992). This result explains the RMA-S phenotype and its apparent "leak" in reference to the VSV-presentation (Esquivel, F. et al, J. Exp Med 175: 163, 1992; Hosken, NA and MJ Bevan,... J. Exp Med 175:.. 719, 1992). TAP-1 allein schien zur VSV-Präsentation in RMA-S-Zellen und in transfizierten CMT.64-Zellen auszureichen, und sie können ein Homodimer bilden, das die Translokation spezifischer Peptide in das Lumen des ER bewirken kann. TAP-1 alone seemed to VSV-presentation in RMA-S cells and in transfected cells CMT.64 be sufficient, and they can form a homodimer, which may cause the translocation of specific peptides in the lumen of the ER. Neben den Transportern kann der Unterschied im RMA-S- und CMT.64-Phänotyp auf einem Niveau erklärt werden durch die größere Menge viraler Peptide, die in den RMA-S-Zellen erzeugt wird. In addition to transporters, the difference in the RMA-S and CMT.64 phenotype may be explained at one level by the higher amount of viral peptides generated in RMA-S cells. Es scheint interessanterweise, dass eine totale Repression der Expression beider LMPs und TAPs, die sich in dem gleichen Bereich der Klasse II befinden, hineichen, dass jegliche Expression der Klasse I auf der Zelloberfläche vermieden wird. It seems interesting to note that a total repression of expression of both LMP and TAP, which are located in the same region of class II, hineichen that any expression of class I on the cell surface is avoided. Dies kann für einige Krebszellen sehr wichtig sein (Brodsky, FM et al., Eur. J. Immunol. 9: 536, 1979; Restifo, NP et al., J. Exp. Med. 177: 265, 1993 und Bikoff, EK et al., Eur. J. Immunol. 21: 1997, 1991), indem ein Verfahren bereitgestellt wird, durch das Tumorzellen der Immunüberwachung entgehen. This can be very important for some cancer cells may be (Brodsky, FM et al, Eur J Immunol 9: 536, 1979; Restifo, NP et al, J Exp Med 177:...... 265, 1993 and Bikoff, EK et al, Eur J. Immunol. 21:.. 1997, 1991) by providing a method is provided by which tumor cells escape immune surveillance.
  • BEISPIEL 9 EXAMPLE 9
  • TAP-Genexpressions-Profile von CMT.64 und CMT.64/R1-4 TAP gene expression profiles of CMT.64 and CMT.64 / R1-4
  • [0099] [0099]
    Zur Untersuchung der Fähigkeit von TAP-1 zur unabhängigen Funktion beim Peptidtransport, wurde die Ratten-TAP-1-cDNA in die Kleinzelllungenkarzinomzelllinie CMT.64 aus Maus, die keine endogene TAP-1- oder TAP-2-mRNA exprimiert, eingebracht ( To investigate the ability of TAP-1 for independent function in peptide transport, the rat TAP-1 cDNA was placed in the small cell lung carcinoma cell line CMT.64 from mouse that does not express endogenous TAP-1 or TAP-2 mRNA ( 10 10 ). ). Die endogenen TAP-Gene, sowie diejenigen, die die mutmaßlichen Proteasomen-Komponenten LMP2 und 7 codieren, werden nur nach IFN-γ-Behandlung exprimiert ( The endogenous TAP genes, as well as those that encode the putative proteasome components LMP2 and 7, are expressed only after IFN-γ treatment ( 10 10 ). ). Die positiven Transfektanten wurden mittels Neophosphotransferase-Selektionssystem selektiert, und die konstitutive Expression des TAP-1-Gens durch Northern-Blotting bestätigt. Positive transfectants were selected using neophosphotransferase selection system, and confirms the constitutive expression of the TAP-1 gene by Northern blotting.
  • [0100] [0100]
    Insbesondere die Transfektion von CMT.64-Zellen mit Ratten-cDNA-TAP-1 (in dem pHb Apr-1-Neo-Expressionsvektor wie in Powis, SJ et al., Nature 354, 528–531 (1991) beschrieben), wurde durch Lipofektion (Lipofectin, BRL) erzielt, wobei 10 μg DNA verwendet wurden. In particular, transfection of CMT.64 cells with rat cDNA TAP-1 (in the pHb Apr-1-neo expression vector as described in Powis, SJ et al., Nature 354, 528-531 (1991)), was achieved by lipofection (Lipofectin, BRL) with 10 g of DNA were used. Die Selektion erfolgte in 1 mg/ml G418 (Gibco). Selection was in 1 mg / ml G418 (Gibco). Die Gesamt-RNA wurde mit Guanidinisothiocyanat isoliert und auf einem 1 % Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, das 2,2 M Formaldehyd enthielt (10 μg/Spur). Total RNA was isolated using guanidine isothiocyanate and separated by electrophoresis on a 1% agarose gel containing 2.2 M formaldehyde (10 ug / lane). Das Blotting und die Hybridisierung mit [ 32 P]-markierten cDNAs (TAP-1 und 2) oder Oligonukleotid (Aktin) wurde wie hier beschrieben durchgeführt. Blotting and hybridisation with [32 P] -labelled cDNAs (TAP-1 and 2) or oligonucleotide (actin) were carried out as described herein.
  • [0101] [0101]
    Sowohl TAP-1- als auch -2-mRNA-Transkripte fehlten in nicht-induzierten CMT.64-Zellen, wurden aber in CMT.64-Zellen erfasst, die in der Gegenwart von 200 Units/ml Maus-rekombinantem IFN-γ für 48 Std. gezüchtet wurden ( Both TAP-1 and -2 mRNA transcripts were absent in uninduced CMT.64 cells but were detected in CMT.64 cells for in the presence of 200 Units / ml recombinant murine IFN-γ 48 hours were grown. ( 10 10 ). ). CMT64/r1-4 exprimierte hohe Mengen vektorstämmiger TAP-1-mRNA, blieb jedoch für TAP-2 negativ. CMT64 / r1-4 expressed high levels of vector-born TAP-1 mRNA, but remained negative for TAP-2. Aktin-mRNA wurde zur Demonstration verwendet, dass gleiche Mengen RNA aufgetragen wurden. Actin mRNA was used to demonstrate that equal amounts of RNA were applied.
  • [0102] [0102]
    Drei stark exprimierende Klone wurden für anschließende Experimente ausgewählt ( Three high expressing clones were selected for subsequent experiments ( 10 10 ). ). Drei Klone, die nur mit dem Vektor transfiziert wurden, wurden ebenfalls selektiert und als Kontrollen in den anschließenden Experimenten verwendet. Three clones transfected with vector alone were also selected and used as controls in the subsequent experiments.
  • BEISPIEL 10 EXAMPLE 10
  • TAP-1-Expression reicht zur Erhöhung der Menpen K b und D b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen aus TAP-1 expression is sufficient to increase the Menpen K b and D b of the cell surface of CMT.64 cells
  • [0103] [0103]
    CMT.64-Zellen exprimieren fast keine Oberflächen-MHC-Klasse-I-Moleküle, trotz der Synthese von D b - und K b -schwere Ketten (Jefferies, WA et al., siehe oben, 1993). CMT.64 cells express almost no surface MHC class I molecules, despite synthesis of D b - b K and severity chains (Jefferies, WA et al, supra., 1993). Zur Bestimmung des Einflusses von TAP-1 auf die Oberflächen-Klasse I-Expression, erfolgte eine Durchflusscytometrie mit Antikörpern gegen D b und K b . Insbesondere die Zellen wurden mit oder ohne Primärantikörper für 1 Std. inkubiert. To determine the influence of TAP-1 on surface class I expression, flow cytometry was performed using antibodies against a D b and K b. Specifically, the cells were incubated with or without primary antibody for 1 hour.. Alle Inkubationen wurden bei 4°C durchgeführt. All incubations were carried out at 4 ° C. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit fluoresceinisothiocyanat-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Ig-Antikörper (20 mg/ml) für eine weitere Std. inkubiert. After washing, the cells were (20 mg / ml) were incubated with fluorescein isothiocyanate-conjugated goat anti-mouse Ig-antibody for an additional hour.. Nach zwei Runden Waschen wurden die Zellen in 1,5% Paraformaldehyd fixiert. After two rounds of washing, the cells were fixed in 1.5% paraformaldehyde. Die fluoreszierenden Profile wurden erhalten durch Analyse von 5000 Zellen in einem halblogarithmischen Schema mit dem FACScan ® -Programm. The fluorescent profiles were obtained by analysis of 5000 cells in a semi-logarithmic diagram with the FACScan ® program.
  • [0104] [0104]
    Die Durchflusscytometrie-Analyse zeigte, dass die TAP-1-Expression zur Steigerung der Mengen von K b und D b an der Zelloberfläche von CMT.64-Zellen, wie in der The flow cytometry analysis demonstrated that TAP-1 expression to increase the amounts of K b and D b at the cell surface of CMT.64 cells as shown in 11 11 gezeigt, ausreichte. shown sufficient. Die Antikörper 28.14.8s und Y-3 erkennen D b bzw. The antibodies recognize 28.14.8s and Y-3 D b or K b . In allen Feldern sind die mit dem angegebenen Primärantikörper erhaltenen Ergebnisse durch eine durchgezogene Linie gezeigt. K b. In all areas, the results obtained with the indicated primary antibodies are shown by a solid line. Die gepunktete Linie veranschaulicht die Werte, die in der Abwesenheit eines Primärantikörpers erhalten werden. The dotted line illustrates the values which are obtained in the absence of primary antibody. Die gezeigten Ergebnisse veranschaulichen drei unabhängige Experimente. The results shown illustrate three independent experiments.
  • [0105] [0105]
    Für beide untersuchten Antikörper bestand ein erfassbarer Anstieg der Oberflächenexpression in den CMT-TAP-1-Transfektanten, verglichen mit CMT-64 und den Vektorkontrollen, was nahe legt, dass TAP-1 allein die Peptide zur Stelle des MHC-Zusammenbaus brachte, so dass stabile Komplexe entstehen konnten, die zur Zelloberfläche transportiert und dort exprimiert werden konnten. For both investigated antibodies was a detectable increase in surface expression in the CMT-TAP-1 transfectants compared to CMT-64 and the vector controls, suggesting that TAP-1 alone did the peptides to the site of MHC assembly, so that stable complexes could occur, which could be transported to the cell surface and expressed therein. Die Menge des Transferrin-Rezeptors, der an der Zelloberfläche exprimiert wurde, blieb durch die Transfektion von TAP-1 unverändert, was zeigt, dass dies keine allgemeine Wirkung auf die Plasmamembranproteine hatte (Daten nicht gezeigt). The amount of transferrin receptor, which was expressed at the cell surface, remained by the transfection of TAP-1 unchanged, which indicates that this is not a general effect on plasma membrane proteins had (data not shown). Im Gegensatz zu anderen Systemen, wo es nicht möglich war, die Beteiligung eines alternativen Mechanismus des Peptidtransports unberücksichtigt zu lassen (Hosken, NA & Bevan, MJJ Exp. Med. 175: 719–729 1992; Esquivel, F., Yewdell, J & Bennink, JJ Exp. Med. 175: 163–168, 1992; Zweerink, HJ et al., J. Immunol. 150: 1763–1771, 1993), zeigen diese Ergebnisse eindeutig die Fähigkeit von TAP-1 zur Steigerung der Oberflächen-Klasse-I-Expression bei Fehlen von TAP-2 in CMT-64-Zellen. Unlike other systems, where it was not possible to have the participation of an alternative mechanism of peptide transport are excluded (Hosken, NA & Bevan, MJJ Exp Med 175: 719-729, 1992; Esquivel, F., Yewdell, J &.. . Bennink, JJ Exp Med 175: 163-168, 1992; Zweerink, HJ et al, J. Immunol 150:... 1763-1771, 1993), these results clearly demonstrate the ability of TAP-1 to increase surface class I expression in the absence of TAP-2 in CMT-64 cells.
  • BEISPIEL 11 EXAMPLE 11
  • Pulse-Chase-Analyse von K b - und D b -Molekülen aus CMT.64- und TAP-1-transfizierten CMT-64-Zellen Pulse-chase analysis of K b - and D b molecules from CMT.64- and TAP-1 transfected CMT-64 cells
  • [0106] [0106]
    Der intrazellulärer Transport von Klasse-I-schwerer Kette zur Zelloberfläche ist von der Prozessierung zu einer höhermolekularen Form begleitet durch Modifikation des N-verknüpften Glycans während der aufeinander folgenden Exposition gegenüber Golgi-spezifischen Enzymen. The intracellular transport of class I heavy chain to the cell surface is accompanied by processing to a higher molecular weight form by modification of the N-linked glycans during successive exposure to Golgi-specific enzymes. Es wurden daher Pulse-Chase-Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine solche Prozessierung in den CMT-TAP-1-Transfektanten erzielt wurde, wie es durch den Anstieg der Oberflächenexpression von K b und D b vorhergesagt wird. There were therefore performed pulse-chase experiments to determine whether such a processing in the CMT-TAP-1 transfectants was achieved, as indicated by the increase in surface expression of K b and D b is predicted.
  • [0107] [0107]
    Pulse-Chase und Immunfällung von K b und D b erfolgten mit einem 15-Minuten-Puls mit 35 S-Methionin (Amersham) und monoklonalen immungefällten 28.14.8s (anti-D b ) und Y-3 (anti-K b )-Antikörpern nach den vorstehend beschriebenen Verfahren. Pulse-chase and immunoprecipitation of K b and D b were performed with a 15-minute pulse with 35 S-methionine (Amersham) and immunoprecipitated 28.14.8s monoclonal (anti-D b) and Y-3 (anti-K b) - antibodies by the methods described above. Die Proben wurden mit SDS-PAGE auf 10–15%igen Gelen analysiert und mit einer Amplifikationslösung behandelt. The samples were analyzed by SDS-PAGE on 10-15% gels and treated with a solution of amplification solution. Das Autoradiogramm wurde nach 10 Tagen entwickelt. The autoradiogram was developed after 10 days.
  • [0108] [0108]
    Der Transport von K b - und D b -Molekülen zur Zelloberfläche erfolgte in den TAP-1-transfizierten Zellen, wie es durch den Anstieg des Molekulargewichts der schweren Kette während der Oligosaccharid-Seitenketten-Prozessierung ( The transport of K b - and D b molecules to the cell surface occurred in the TAP-1 transfected cells, as indicated by the increase in molecular weight of the heavy chain during oligosaccharide side chain processing ( 12 12 ) angezeigt wird. ) Is displayed. Bei nicht transfizierten CMT.64-Zellen wurde keine Prozessierung beobachtet ( In untransfected CMT.64 cells no processing was observed ( 12 12 ), was die Zurückhaltung innerhalb des endoplasmatischen Reticulums oder cis-Golgi anzeigt. ), Indicating the retention within the endoplasmic reticulum or cis-Golgi. Dies wurde durch die Empfindlichkeit gegenüber Endoglycosidase H bestätigt (Daten nicht gezeigt). This was confirmed by sensitivity to endoglycosidase H confirmed (data not shown).
  • [0109] [0109]
    Zusammengefasst ergab der Vergleich zwischen CMT.64 und CMT64/r1-4, dass die Anwesenheit von TAP-1- die Prozessierung von D b und K b ermöglichte ( In summary, a comparison between CMT.64 and CMT64 / r1-4, that the presence of TAP-1 enabled the processing of D b and K b ( 12 12 ). ). Zudem wurde durch Endoglycosidase H-Behandlung bestätigt, dass die höhermolekularen prozessierten Formen von K b und D b resistent gegenüber Spaltung waren (Daten nicht gezeigt). Moreover, it was confirmed by endoglycosidase H treatment that the higher molecular weight processed forms of K b and D b (data not shown) were resistant to cleavage. Diese Ergebnisse bestätigen weiter die Bedeutung von TAP-1 für den Transport und die Oberflächenexpression von MHC-Klasse-I-Molekülen in diesen Zellen. These results further confirm the importance of TAP-1 for the transport and surface expression of MHC class I molecules in these cells.
  • BEISPIEL 12 EXAMPLE 12
  • TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen präsentieren effizient Antigen an VSV-spezifische CTL TAP-1-transfected cells CMT.64 efficiently present antigen to VSV-specific CTL
  • [0110] [0110]
    In vorhergehenden Untersuchungen wurde festgelegt, dass CMT.64-Zellen keine VSV-Peptide an cytolytische T-Lymphozyten (CTL) präsentieren konnten, wenn sie nicht mit IFN-γ vorbehandelt waren, oder direkt mit einem synthetischen Peptid inkubiert waren, das von dem VSV-N-Protein hergeleitet wurde (Jefferies, et al., J. Immunol. 151: 2974–2985, 1993). In previous studies, it was determined that CMT.64 cells could present no VSV-peptides to cytolytic T lymphocytes (CTL), if they were not pretreated with IFN-γ, or were directly incubated with a synthetic peptide derived from the VSV was derived -N-protein (Jefferies, et al, J. Immunol. 151:. 2974-2985, 1993). Zur Untersuchung der Fähigkeit der TAP-1-Expression zur Komplementierung der funktionellen Antigen-Prozessierung und Präsentation wurden Chrom-Freisetzungstests mit VSV-spezifischen CTL mittels CMT.64 und CMT-TAP-1- und CMT-Vektortransfektanten als Ziele durchgeführt. To investigate the ability of TAP-1 expression to complement functional antigen processing and presentation chromium release assays were carried out with VSV-specific CTL using CMT.64 and CMT-TAP-1 and CMT-Vektortransfektanten as targets.
  • [0111] [0111]
    Insbesondere wurden CMT.64-Zellen (CMT) und CMT-TAP-1-Transfektanten mit VSV (MOI: 2) für 8 bis 10 Std. infiziert, oder mit dem Influenza-Stamm A/PR/8/34 für 48 Std. (bei 300 HA-Einheiten für RMA, und 500 HA-Einheiten für CMT.64 und ihren Derivate) behandelt. In particular CMT.64 cells (CMT) and CMT-TAP-1 transfectants with VSV (MOI: 2) were. For 8 to 10 h infected or infected with the influenza strain A / PR / 8/34 48 hrs. treated (at 300 HA units for RMA, and 500 HA units for CMT.64 and their derivatives). Effektor-CTL-Populationen wurden durch Infektion von C57bl/6-Mäusen mit VSV in den Pfotenballen und Ohren oder 700 HA-Einheiten Influenza ip erzeugt. Effector CTL populations were generated by infecting C57bl / 6 mice with VSV in the foot pads and ears or 700 HA units of influenza ip. VSV-CTL wurden hergeleitet von abführenden Lymphknoten, wie sie an Tag 5 nach der Immunisierung gesammelt wurden, und Einzelzellsuspensionen wurden bei 4 × 10 6 Zellen pro ml für 3 Tage in Abwesenheit jeglicher Restimulation gezüchtet. VSV CTL were derived from draining lymph nodes as collected on day 5 post immunization and single cell suspensions were 10 6 cells per ml cultured at 4 × for 3 days in the absence of any restimulation. Influenza-CTL wurden 4 bis 5 Wochen nach der Immunisierung von Splenocyten hergeleitet, die in Gegenwart von Influenza-infizierten Stimulatoren für 6 Tage gezüchtet wurden. Influenza CTL were 4 to 5 weeks after immunization derived from splenocytes were cultured in the presence of influenza infected stimulators for 6 days. Das Kulturmedium bestand aus einem 1:1-Verhältnis von RPMI-1640 und NCTC-109, supplementiert mit 10% FBS, L-Glutamin, Pen/Strep, und 2 ME. The culture medium consisted of a 1: 1 ratio of RPMI-1640 and NCTC-109 supplemented with 10% FBS, L-glutamine, pen / strep, and 2 ME. Ziele und Effektoren wurden gemischt und 4 Std. inkubiert. Targets and effectors were mixed and incubated for 4 h.. Scheininfizierte Zellen (+---) wurden als negative Kontrollen verwendet. Mock-infected cells (+ ---) were used as negative controls. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als % spezifische Freisetzung, wie eingehend beschrieben in Jefferies, WA Kolaitis, G. & Gabathuler, RJ Immunol. The results are expressed as% specific release, as described in detail in Jefferies, WA Kolaitis, G. & Gabathuler, RJ Immunol. 151, 2974–2985 (1993). 151, 2974-2985 (1993).
  • [0112] [0112]
    Die in der In the 13 13 veranschaulichten Ergebnisse zeigen, dass TAP-1-transfizierte CMT.64-Zellen (Klone CMT-r1.1, r1-4 und r1-10) gegen VSV-spezifische CTL effizient Antigen präsentieren. illustrated results show that TAP-1-transfected CMT.64 cells (clones CMT-r1.1, r1-4 and R1-10) against VSV-specific CTL efficiently present antigen. Die Einführung von TAP-1 in CMT.64-Zellen stellt die Antigenpräsentation nach der VSV-Infektion wieder her. The introduction of TAP-1 in CMT.64 cells, the antigen presentation after VSV infection restores. Wildtyp-CMT.64-Zellen und vektortransfizierte CMT-Zellen, die mit VSV-infiziert sind, werden nicht durch CTL erkannt. Wild-type cells and CMT.64 vektortransfizierte CMT cells infected with VSV, are not recognized by CTL. 17 17 zeigt, dass Influenza-Virus nicht an spezifische CTL durch CMT-TAP1-Zellen präsentiert wird. shows that Influenza virus is not presented to specific CTL by CMT-TAP1 cells. CMT.64-, RMA- und CMTr1.4-Zellen wurden mit Influenza-Virus infiziert und influenzaspezifischen CTL ausgesetzt. CMT.64-, RMA and CMTr1.4 cells were infected with influenza virus and influenza-specific CTL exposed. In diesem Fall gab es jedoch keine Erkennung der CMT-TAP-1-Zellen. In this case, however, there was no recognition of the CMT-TAP-1 cells. Beide positiven Kontrollen, RMA und CMT.64 + Inf, wurden effizient durch CTL lysiert. Both positive controls, RMA and CMT.64 + Inf, were efficiently lysed by CTL.
  • [0113] [0113]
    Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, welche zeigen, dass die VSV-Expression nur die Expression des TAP-1-Transporters erfordert, und dass die Erkennung von CMT.64-Zellen, die das Ratten-TAP-1-allein exprimierten, fast so effizient ist, wie Zellen, die beide Transporter TAP-1 und TAP-2 exprimieren. Additional experiments were conducted which demonstrate that VSV expression requires only the expression of the TAP-1 transporter, and that recognition of CMT.64 cells expressing the rat TAP-1 alone is almost as efficient as cells expressing both transporter TAP-1 and TAP-2. Die Expression von nur TAP-2 schien nicht so effizient zu sein ( The expression of TAP-2 just did not seem to be as effective ( 14 14 ). ). Verschiedene Ratten-TAP-1-Klone wurden ebenfalls analysiert und bestätigten die vorhergehenden Schlussfolgerungen ( Various rat TAP-1 clones were also analyzed and confirmed the previous conclusions ( 15 15 ). ).
  • [0114] [0114]
    Influenza-Virus-infizierte Zellen werden nur bei Vorhandensein beider Ratten-TAP-Gene effizient erkannt ( Influenza virus-infected cells are recognized efficiently only in the presence of both rat TAP genes ( 16 16 bis to 18 18 ). ). Die The 16 16 zeigt, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, effizient nach der Influenza-Infektion erkannt werden. shows that RMA cells and CMT.64 cells treated with IFN-γ are recognized efficiently after influenza infection. CMT.64-Zellen, die mit dem Ratten-TAP-1-Gen transfiziert wurden, werden nicht erkannt. CMT.64 cells transfected with the rat TAP-1 gene are not recognized. Die The 17 17 zeigt die gleichen Ergebnisse, die in einem zweiten unabhängigen Experiment beobachtet werden. shows the same results observed in a second independent experiment. Die The 18 18 zeigt zudem, dass RMA-Zellen und CMT.64-Zellen, die mit IFN-γ behandelt wurden, CMT.64-Zellen, die mit beiden Ratten-TAP-Genen behandelt wurden, nach der Influenza-Virusinfektion erkannt werden. also shows that RMA cells and CMT.64 cells treated with IFN-γ, CMT.64 cells treated with both rat TAP genes are recognized after influenza virus infection. 19 19 zeigt, dass HSV-infizierte Zellen durch spezifische CTL erkannt werden, unabhängig von der Expression des Ratten-TAP-1- und/oder TAP-2-Transportergens. shows that HSV infected cells are recognized by specific CTL independently of the expression of the rat TAP-1 and / or TAP-2 transporter gene.
  • [0115] [0115]
    Diese Ergebnisse beweisen, dass ein einzelnes TAP-1-Transportermolekül die Antigenpräsentationsfähigkeit für eine defiziente Zelle in Abwesenheit von TAP-2 wiederherstellen kann. These results demonstrate that a single TAP-1 transporter molecule can restore the ability of antigen presentation for a deficient cell in the absence of TAP-2. Dieser Befund stimmt mit der jüngeren Beobachtung überein, dass das TAP-1-Protein mit der MHC-Klasse-I-schweren Kette in Zellen wechselwirkt, die TAP-2 nicht exprimieren (Suh, WK., et al., Science 264: 1322–1326, 1994). This finding is consistent with the recent observation agreed that the TAP-1 protein interacts with the MHC class I heavy chain in cells that TAP-2 do not express (Suh, WK, et al, Science 264:.. 1322 -1326, 1994). Dies stellt die absolute Anforderung für eine Heterodimerbildung zwischen den beiden mutmaßlichen Transportermolekülen in Frage und zeigt, dass verschiedene Formen des Transporterkomplexes funktionell sind und den Transport verschiedener Untergruppen des Antigenpeptidpools für den Zusammenbau mit MHC-Klasse-I-Molekülen vermitteln. This represents the absolute requirement for a heterodimer between the two putative transporter molecules in question shows that various forms of the transporter complex are functionally and mediate the transport of various subgroups of the antigen peptide pools for assembly with MHC class I molecules.
  • BEISPIEL 13 EXAMPLE 13
  • Wirkungen von TAP auf das Tumor-Überleben Effects of TAP on tumor survival
  • [0116] [0116]
    Mäusen wurden CMT.64-Zellen oder CMT.12.12-Zellen (ein Ratten-TAP-1- und TAP-2-transfizierter Klon) ip bei 2 × 10 5 und 5 × 10 5 Zellen pro Maus injiziert. Mice CMT.64 cells or CMT.12.12 cells (a rat TAP-1 and TAP-2 transfected clone) ip at 2 x 10 5 and 5 × 10 5 cells injected per mouse. Die Zelllinien wurden vor dem Animpfen in die Empfänger-Maus in PBS resuspendiert. The cell lines were resuspended prior to inoculation into the recipient mouse in PBS. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. The results are shown in Table 2. Eine der Mäuse, die mit 5 × 10 5 CMT.64-Zellen behandelt wurde, wurde getötet und eine Autopsie ergab klar das Vorhandensein eines soliden Tumors an der Injektionsstelle. One of the mice treated with 5 x 10 5 CMT.64 cells was sacrificed and an autopsy clearly revealed the presence of a solid tumor at the injection site. Zudem waren sämtliche mesenterischen Lymphknoten stark vergrößert. In addition, all mesenteric lymph nodes were greatly enlarged.
  • BEISPIEL 14 EXAMPLE 14
  • [0117] [0117]
    Es folgt ein experimenteller Ansatz zum Auffinden der Peptide, die im ER durch TAP-1-Transporter, TAP-2-Transporter und TAP-1-TAP-2--Transporter transloziert werden. The following is an experimental approach for finding the peptides by TAP-1 transporter TAP-2 transporter TAP-1 and TAP-2 in the ER - are translocated transporter.
    • 1. Verwendung von Zelllinien, die TAP-1, TAP-2 und TAP-1 TAP-2-Transporter exprimieren; 1. The use of cell lines expressing TAP-1 and TAP-TAP-2 1 TAP-2 transporter; beispielsweise CMT.64-Zellen, die mit cDNA aus TAP-1 und TAP-2, CMT.64, CMT.1-4, CMT.2-10, CMT.12-12 transfiziert sind. For example, CMT.64 cells transfected with cDNA from TAP-1 and TAP-2, CMT.64, CMT.1-4, CMT.2-10, CMT.12-12.
    • 2. Subzelluläre Fraktionierung dieser Zellen. 2. Subcellular fractionation of these cells.
    • 3. Isolation des ER (endoplasmatischen Reticulums) 3. Isolation of the ER (endoplasmic reticulum)
    • 4. Extraktion der Peptide aus dem ER in 0,1 % TFA. 4. Extraction of the peptides from the ER in 0.1% TFA.
    • 5. Gelfiltration. 5. gel filtration.
    • 6. Reverse-Phasen-HPLC. 6. Reverse-phase HPLC.
    • 7. Die Fraktionen können gesammelt und auf CTL-Sensibilisierung oder auf Radioaktivität untersucht werden, wenn die Zellen markiert wurden. 7. Fractions can be collected and tested for CTL sensitization or for radioactivity if cells were labeled.
    • 8. Schließlich Aminosäure-Sequenzierung. 8. Finally, amino acid sequencing.
  • [0118] [0118]
    Vergleich des HPLC-Profils aus verschiedenen Zelllinien, die verschiedene TAP-Transporter exprimieren, bieten eine Information über die Peptid-Transportabhängigkeit von TAP-Molekülen. Comparison of HPLC profile from different cell lines expressing different TAP transporters, provide information about peptide transport dependency on TAP molecules. Peptid-Peaks können isoliert und analysiert werden. Peptide peaks can be isolated and analyzed. Die Sequenzierung der Peptide bietet Information über das Motiv, das für den Transport mit TAP-1 allein, TAP-2 allein oder TAP-1- und TAP-2-Molekülen notwendig ist. The sequencing of the peptides provides information on the subject, which is necessary for transport by TAP-1 alone, TAP-2 alone or TAP-1 and TAP-2 molecules. Das Protokoll für die Peptidanalyse und Sequenzierung ist Standard und beschrieben in den Veröffentlichungen von Rammensee und von Engelhard. The protocol for peptide analysis and sequencing is standard and described in the publications by Rammensee and Engelhard.
  • BEISPIEL 16 EXAMPLE 16
  • Antisense-Knockout in RMA-S-Zellen Antisense Knockout in RMA-S cells
  • [0119] [0119]
    Dieses vorläufige Experiment erfolgte auf im Großmaßstab selektierten Populationen der Zellen. This preliminary experiment was carried out on selected large scale populations of cells. Das verwendete Konstrukt war das gleiche pHβA-neo, mit dem sämtliche MTP 1- und -2-Klone wie vorstehend beschrieben erhalten wurden. The construct used was the same pHβA-neo, with all the MTP 1 and -2 clones were obtained as described above. In dieser Untersuchung wurde das MTP1-cDNA-Insert ausgeschnitten und durch eine Sequenz in der entgegengesetzten Richtung ersetzt. In this study the MTP1 cDNA insert was cut out and replaced with a sequence in the opposite direction. RMS-Zellen haben nur TAP-1, nicht TAP-2, so dass nur MTP-1-antisense verwendet wurde. RMS cells have been only TAP-1, TAP-2 not so that only uses MTP-1 antisense. Die nachstehenden Daten stammen aus einer Einfarben-FACS-Analyse, die Zahlen sind linear (5000 Ereignisse gezählt/Probe). The following data are from a single-color FACS analysis, the numbers are linear (5,000 events counted / sample). Der 28.14.8s-Antikörper ist spezifische für Db, und der Y-3-Antikörper ist spezifisch für K b . Das Antisense-Konstrukt wird als RMA-S.ptml bezeichnet. 28.14.8s the antibody is specific for Db, and the Y-3 antibody is specific for K b. The antisense construct is designated RMA-S.ptml.
  • BEISPIEL 17 EXAMPLE 17
  • Wirkung von TAP-1 und TAP-2 auf das Überleben der Mäuse denen Tumorzellen injiziert wurden Effect of TAP-1 and TAP-2 on the survival of mice with tumor cells were injected
  • [0120] [0120]
    Das Überleben syngener C57bl/6- und allogener Kontroll-Balb/C-Mäuse, denen sehr hohe Dosen CMT.64-Zellen injiziert wurden (aus C57BI/6-Mäusen) oder CMT.12.12-Zellen (CMT-64-Zellen, die mit TAP-1 und TAP-2-Zellen transfiziert wurden) wurde folgendermaßen untersucht. The survival of syngeneic C57BL / 6 and control allogeneic Balb / C mice injected with very high doses of CMT.64 cells were injected (from C57BI / 6 mice) or CMT.12.12 cells (CMT-64 cells were transfected with TAP-1 and TAP-2 cells) was examined as follows.
  • [0121] [0121]
    5 × 10 5 CMT.64 oder CMT.12.12-Zellen wurden in Mäuse intraperitoneal injiziert und die Mäuse wurden 90 Tage überwacht. 5 × 10 5 or CMT.12.12 CMT.64 cells were injected intraperitoneally into mice and the mice were monitored for 90 days. Die Mäuse wurden nach dem Tod oder nach 90 Tagen einer Autopsie unterworfen. The mice were subjected after death or after 90 days of an autopsy. Das Überleben der Mäuse ist in der The survival of the mice is in the 20 20 gezeigt. shown. Die Ergebnisse der Autopsien sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. The results of the autopsies are summarized in Table 3. All den syngenen C57BL/6-Mäusen, denen CMT-64-Zellen injiziert wurden, waren vor 60 Tagen tot. Es stellte sich heraus, dass diese Mäuse invasive generalisierte metastasierte Tumore im ganzen Körper hatten, und sie aufgebrochene Organe und/oder perforierte Därme mit übermäßiger Flüssigkeit in der Peritonealhöhle aufwiesen. All the syngeneic C57BL / 6 mice, which CMT-64 cells were injected were 60 days ago dead. It was found that these mice had invasive generalized metastatic tumors throughout the body, and broken bodies and / or perforated intestines had with excessive fluid in the peritoneal cavity. Dies wurde als Typ-B-Pathologie klassifiziert. This was classified as type B pathology. Etwa 20% der syngenen Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, waren nach 60 Tagen noch am Leben, und 3 der 20 waren nach 90 Tagen noch am Leben. About 20% of syngeneic mice, which CMT.12.12 cells were injected, after 60 days still alive, and 3 of the 20 were still alive after 90 days. 17 dieser Mäuse von insgesamt 20 hatten eine Typ-B-Pathologie, 2 hatten keine offensichtliche Pathologie und eine hatte die nachstehend beschriebene Typ-A-Pathologie. 17 of these mice had a total of 20 type B pathology, 2 had no obvious pathology and had the below-described type A pathology.
  • [0122] [0122]
    Etwa 70% der allogenen Kontrollmäuse, denen CMT.64-Zellen injiziert wurden, waren nach 90 Tagen noch am Leben, und wiesen keine signifikante Pathologie auf. About 70% of allogeneic control mice, which CMT.64 cells were injected at 90 days were still alive, and had no significant pathology on. Die wenigen Ratten, die eine Pathologie aufwiesen, hatten nur kleine Tumore (4 bis 15 mm) an der Injektionsstelle. The few rats that showed a pathology had only small tumors (4-15 mm) at the injection site. Dies wurde als Typ-A-Pathologie klassifiziert. This was classified as type A pathology. 100% der allogenen Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, waren nach 90 Tagen am Leben, und zeigten keine Pathologie. 100% of allogeneic mice, which CMT.12.12 cells were injected, were alive after 90 days, and showed no pathology.
  • [0123] [0123]
    Die Ergebnisse zeigen, dass syngene Mäuse, denen CMT.12.12-Zellen injiziert wurden, länger überlebten, als diejenigen, die mit CMT.64-Zellen transfiziert wurden, möglicherweise aufgrund der verbesserten MHC-Klasse I-Antigen-Präsentation und Erkennung durch das Wirts-Immunsystem. The results show that syngeneic mice injected with CMT.12.12 cells were injected survived longer than those transfected with CMT.64 cells, probably due to improved MHC Class I antigen presentation and recognition by the host -Immunsystem. Die syngenen Mäuse, die mit CMT.12.12 transfiziert wurden, und die nach 90 Tagen überlebten, zeigten keine oder nur geringfügige Pathologie. The syngeneic mice transfected with CMT.12.12, and who survived after 90 days showed no or little pathology. TABELLE 1 TABLE 1 TABELLE 2 TABLE 2 TABELLE 3 TABLE 3
Classifications
International ClassificationA61K38/00, A61K48/00, A61K31/70, A61K38/17, C07K14/47, A61K39/145, A61K35/76, A61K39/00, A61P35/00, C12N15/12, C12N15/09, A61P37/04
Cooperative ClassificationC07K14/47, A61K38/00
European ClassificationC07K14/47
Legal Events
DateCodeEventDescription
11 Jan 20078364No opposition during term of opposition