DE60030173T2

DE60030173T2 - Neue Indikationen für Mannan-binding Lectin (MBL) zur Behandlung von immungeschwächten Patienten

Info

Publication number: DE60030173T2
Application number: DE60030173T
Authority: DE
Inventors: Steffen Thiel; Jens Christian Jensenius
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-05-14
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2020-05-11
Also published as: DK1181363T3; DK1181038T3; CA2372435A1; CN1359420A; US20040229212A1; DE60033147D1; ATE264111T1; PT1181363E; US7439224B2; EP1402897B1; CN1359298A; AU779404B2; PT1181038E; NO20015481D0; WO2000069894A3; US20030191052A1; AU4393500A; CA2372128A1; AU4393600A; NZ515718A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Untereinheiten und Oligomeren eines Mannan-bindenden Lektins (MBL) zur Prophylaxe oder Heilbehandlung von immungeschwächten Individuen.
Mehrere Gruppen von Lektinen, d. h. kohlenhydratbindende Proteine sind bekannt. Eine Gruppe sind die C-Typ Lektin. Die C-Typ Lektine haben eine calciumabhängige Kohlenhydraterkennungsdomain (C-Typ CRD)¹. Mannan-bindende Lektine (MBL), synonym werden auch die Begriffe Mannose-bindendes Lektin, Mannan-bindendes Protein oder Mannose-bindendes Protein (MBP) verwendet, gehören in die Untergruppe der C-Typ Lektine, welche Kollektine genannt werden, da diese löslichen Proteine aus Untereinheiten, die drei CRDs an einem Kollagenstiel² präsentieren, aufgebaut sind. MBL interagiert mit Kohlenhydraten, die von einer Vielzahl von Mikroorganismen präsentiert werden und es häufen sich die Beweise, dass es eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunabwehr³ spielt. Sobald MBL an Kohlenhydrate gebunden ist, ist es in der Lage das Komplementsystem zu aktivieren.
Das Komplementsystem kann über drei Wege aktiviert werden: der klassische Weg, der alternative Weg und der dritte, neu beschriebene Weg, nämlich der Mannan-bindende Lektin (MBL)-Weg, welcher durch die Bindung von MBL an Kohlenhydrate, die von Mikroorganismen präsentiert werden, initiiert wird. Die Komponenten des alternativen Weges und des MBL-Weges sind Teile der angeborenen Immunabwehr. Sie werden auch die natürliche oder nicht-klonale Immunabwehr genannt, wohingegen der klassische Wege Antikörper für eine spezifische Immunabwehr einsetzt.
Das menschliche MBL-Protein ist aus bis zu 18 identischen 32 kDa Polypeptidketten²⁷ aufgebaut, wobei jede ein kurzes N-terminales Segment von 21 Aminosäuren mit drei Zysteinresten umfasst, an dieses anschließend sieben Wiederholungen von Kollagenmotiven Gly-X-Y unterbrochen von einem Gln-Rest, gefolgt von weiteren zwölf Gly-X-Y Wiederholungen. Eine kurze, 34 Reste umfassende Verbindungsdomäne ("neck-region") verbindet die C-Terminale, Ca²⁺ abhängige 93 Aminosäuren lange Lektin-Domäne mit dem Kollagenanteil des Moleküles²⁸.
Die Kollagenregionen der drei Polypeptidketten bilden zusammen eine Untereinheit, welche durch Disulfid-Brücken kovalent stabilisiert wird. Einzelne Untereinheiten sind über Disulfid-Brücken sowie durch nicht-kovalente Interaktionen verbunden²⁷.
Die Position dieser Disulfid-Brücken konnte jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt werden. In SDS-PAGE Analysen zeigten sich unter nicht reduzierenden Bedingungen für MBL Banden mit einem scheinbaren Molekulargewicht (MW) von größer als 200 kDa, welche vermutlich Cluster von 3, 4, 5 und sogar 6 verbundenen Untereinheiten²⁷ darstellen.
Die tatsächliche Zahl von Untereinheiten im natürlichen menschlichen MBL-Protein ist strittig. Lipscombe et al. (1995) erzielte Daten durch die Verwendung von Ultrazentrifugation, die nahelegten, dass 25% des menschlichen MBLs aus zwei bis drei Untereinheiten gebildet sind und nur eine kleine Fraktion die Größe von sechs Untereinheiten erreicht. Die relative Quantifizierung wurde mittels Densitometrie von Western Blots, welche mit Chemilumineszenz entwickelt wurden, durchgeführt. Es zeigte sich bei der SDS-PAGE Analyse der Fraktionen einer Ionenaustausch-Chromatografie, dass die vorrangig vorhandenen Bestandteile des kovalent gebundenen MBL aus Tetrameren bestehen, obwohl nur pentamere oder hexamere Komplexe das Komplement aktivierten. Gel-Permeations-Chromatografie (GPC)-Analysen zeigten im Gegensatz dazu, dass MBL in der Größe mit C1-Komplexen vergleichbar ist. GPC kann unter Bedingungen durchgeführt werden, die eine Untersuchung der Bedeutung von schwachen Protein-Protein Interaktionen bei der Bildung von MBL-Molekülen erlauben. Der MBL-Gehalt in einer GPC-Fraktion kann mittels Standard-MBL Assays bestimmt werden.
MBL wird von Hepatozyten in der Leber synthetisiert und ins Blut abgegeben. Es bindet an Kohlenhydratstrukturen von Bakterien, Hefen, parasitischen Einzellern und Viren. Seine antibakterielle Aktivität zeigt sich durch das Abtöten von Mikroorganismen mittels Aktivierung der terminal, lytischen Komplementkomponenten oder durch die Induktion von Phagozytose (Opsonisation). Die sertiforme Struktur des MBL ist ziemlich ähnlich der Bouquet-ähnlichen Struktur des C1q, dem immunglobulinbindenden Unterbestandteil der ersten Komponente im klassischen Weg³. C1q ist mit zwei Serinproteasen, C1r und C1s, zur Bildung des C1-Komplexes assoziiert. Gleichermaßen ist MBL mit zwei Serinproteasen, MASP-1⁵ und MASP-2⁶, sowie einem zusätzlichen Protein, Map19⁷, assoziiert. MASP-1 und MASP-2 haben eine identische modulare Struktur wie C1r und C1s⁶. Die Bindung von MBL an Kohlenhydrate induziert die Aktivierung von MASP-1 und MASP-2. MASP-2 bildet dann die C3-Konvertase, C4bC2b, durch die Spaltung von C4 und C2. Einige Berichte legen es nahe, dass MASP-1 C3 direkt aktivieren kann. Es ist jedoch nichts bekannt über die Stöchiometrie und die Aktivierungssequenz des MBL/MASP-Komplexes. MBL wurde auch in anderen Tieren, z. B. Nagern, Rindern, Hühnern und Affen charakterisiert.
Die Konzentration des MBL im menschlichen Serum ist größtenteils genetisch bestimmt. Es wird jedoch berichtet, dass sie um das dreifache ansteigen kann während einer akuten Phase⁸. Drei Mutationen, die strukturelle Veränderungen bedingen, und zwei Mutationen in der Promoterregion werden mit einem MBL-Mangel assoziiert⁹. Ein MBL-Mangel wird mit einer erhöhten Anfälligkeit für verschiedenste Infektionen in Verbindung gebracht. Untersuchungen an fünf Erwachsenen mit ungewöhnlichen und schweren Infektionen zeigten, dass drei für strukturelle MBL-Mutationen homozygot waren und dass zwei weiter heterozygot waren¹⁰. Bei Untersuchungen an 229 Kindern, die wegen einer nicht HIV-verwandten Immundefizienz an das staatliche dänische Krankenhaus verwiesen wurden, zeigte sich, dass Homozygotie für strukturelle MBL-Allel-Mutationen mit einer 10fach höheren Wahrscheinlichkeit als in der Kontrollgruppe auftraten¹¹. Allotypisierung von 617 fortdauernd im St. Mary's Hospital in London untergebrachten Kindern zeigte eine signifikant höhere Frequenz von Homozygotie und Heterozygotie für mutante Allotypen bei Kindern mit Infekten im Vergleich zu Kindern ohne Infekte¹².
Zahlreiche Oligosaccharide können an MBL binden. Da Zielzucker normalerweise nicht auf Säugerzelloberflächen in höherer Dichte präsentiert werden, erkennt MBL normalerweise keine eigenen Antigene, sondern ist besonders dafür geeignet, mit Zelloberflächen von Mikroben, die sich wiederholende Kohlenhydratstrukturen präsentieren, zu interagieren. Hefe (Candida albicans und Cryptococcus neoformans), Viren (HIV-1, HIV-2, HSV-2 und verschiedene Typen von Influenza A) und zahlreiche Bakterien konnten in vitro von MBL erkannt werden. Im Falle einiger Bakterien wird die Bindung mit MBL durch die Anwesenheit einer Kapsel¹³ beeinträchtigt. Dennoch können auch verkapselte Bakterien (Neiseria meningitidis) starke Bindung an MBL zeigen¹⁴.
Die Mikroorganismen, die Individuen denen MBL fehlt infizieren, finden sich in verschiedensten Spezien von Bakterien, Viren oder Pilzen^12,15-17. Ein Mangel ist auch mit habituellen Aborten in Verbindung zu bringen¹⁸. Tatsächlich könnte MBL ein allgemeingültiges Abwehrmolekül gegen die meisten Bakterien sein und somit als ein Grund betrachtet werden, warum so viele Bakterien nicht pathogen sind.
Beim Sammeln von Daten, die die Ansicht des schützenden Effektes von MBL unterstützen, stößt man jedoch auf Beobachtungen, die es nahelegen, dass Infektionen mit einigen Mikroorganismen, insbesondere intrazellulären Pathogenen, mit höherer Frequenz in MBL-Gesunden als in MBL-Mangel Patienten auftreten^19,20. Dies ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen aus Tierexperimenten, bei denen eine erhöhte Zahl von HSV-2 in der Leber von Mäusen gefunden wurde, die zuvor menschliches MBL injiziert bekamen²¹.
Klinisch reines MBL wurde aus Blutplasmaspenden gewonnen und stellte sich als sicher bei Infusionen heraus²². Die Herstellung von rekombinantem MBL, das eine Struktur und Aktivität ähnlich dem natürlichen MBL hat, wurde ebenfalls erreicht (Patentanmeldung PA 1999 00668/C5/KH).
WO 8901519 offenbart Nukleinsäuren, die für wenigstens 20 aufeinander folgende Aminosäuren des menschlichen Mannose-bindenden Proteins kodieren. Weiterhin wird auch ein Verfahren zur Behandlung von Tieren offenbart, die mit einem Bakterium, Pilz oder Virus infiziert sind. Das Verfahren schließt die Verabreichung eines Peptides, welches an Mannoseuntereinheiten auf diesen Organismen bindet ein. Das Peptid ist dabei in der Lage eine Anheftung von Abwehrzellen des Wirtes an diese Organismen auszulösen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von MBL, welches aus natürlichen Quellen aufgereinigt oder durch rekombinante Technologien produziert wurde oder durch irgendeine andere geeignete MBL-produzierende Zelllinie erhalten wurde, für die Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen. Der Zustand kann mit einer therapeutischen oder medizinischen Behandlung wie z. B. der Verwendung einer zytotoxischen Therapie verbunden werden. Das MBL kann vor oder nach Beginn der medizinischen Behandlung und für eine geeignet erscheinende Zeitdauer gegeben werden.
Die Erfindung betrifft auch die Behandlung von Individuen mit normalen MBL Spiegeln, da solche Individuen z. B. vor einer zelltoxischen Behandlung von der MBL-Gabe profitieren können.
Entsprechend betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform die Behandlung und/oder Prophylaxe von Infektionen in Patienten, die unter immunsupprimierten Zuständen leiden, sowie die Behandlung von Patienten, die einen solchen Zustand durch eine Behandlung, die mit dem Auftreten von immunsupprimierten Zuständen assoziiert wird, erlangen. Beispiele für solche Behandlungen sind z. B. Chemotherapie und Strahlenbehandlung wie z. B. eine Röntgenbehandlung.
Chemo- und Strahlentherapie werden als Teil der Behandlung für mehrere Formen von Krebs angeboten und haben zum einen das Ziel, das Fortschreiten der Krankheit zu verlangsamen oder durch Heilbehandlung das Fortschreiten umzukehren. Chemo- und Strahlentherapie sind immunsupprimierend da Zellen des Immunsystems abgetötet werden und dies zu einem Zustand der Immunsuppression, insbesondere gekennzeichnet durch Neutropenie, führt.
Es wird angenommen, dass MBL seine antimikrobielle Aktivität hauptsächlich durch seine Phagozytose auslösende Aktivität (Vorbereitung von Mikroorganismen für die Phagozytose) ausübt. Diese Aktivität ist abhängig von der Aktivierung des Komplements nach der Bindung von MBL an die mikrobielle Oberfläche und Umlagerung von C4b und C3b an den Mikroorganismus. MBL kann auch das Komplement ausgelöste Abtöten von Mikroorganismen direkt durch die Aktivierung des terminal-lytischen Weges des Komplements und Einführen eines Membranangriffkomplexes (MAC) in die Membran unterstützen. Dieser Mechanismus ist jedoch von geringerer Bedeutung. Zahlreiche Mikroorganismen wie z. B. Gram-positive Bakterien, z. B. Streptococcus pneumonia, sind resistent gegenüber MAC, können jedoch durch Opsonophagozytose eliminiert werden. Opsonophagozytose ist der Hauptmechanismus der MBL-induzierten Beseitigung von Mikroorganismen. Es ist daher eine Überraschung, dass eine MBL-Behandlung für Personen, die einen Mangel an den meisten wichtigen phagozytierenden Zellen, insbesondere den Neutrophilen, haben, vorteilhaft sein kann.
Die Bedeutung von Neutropenie für ein erhöhtes Infektionsrisiko bei Patienten mit Krebs, welche eine zytotoxische Chemotherapie erhalten haben, wurde vor annähernd 30 Jahren erkannt. Infektionen treten daher besonders häufig in Patienten mit hämatologischen oder anderen Krebsleiden auf, die sich einer Chemotherapie oder anderen immunschwächenden therapeutischen Eingriffen unterzogen haben. Synchron mit der intensiveren Verwendung von Chemotherapien sind die Probleme mit Infektionen angestiegen und sind nun die Hauptherausforderung in der begleitenden Therapie²⁴. Dementsprechend investieren alle hämatologischen oder onkologischen Abteilungen intensiv in die Bekämpfung von Infektionen. Dieser Kampf wird durch das Auftreten von mehrfach resistenten Bakterienstämmen zunehmend schwieriger.
Patienten, denen während oder nach einer immunschwächenden Behandlung wichtige zelluläre Bestandteile des Immunsystems fehlen, sind abhängig von einem effizienten angeboren humoralen Immunsystem, wie dem Komplementsystem, z. B. während einer Neutropenie. Nicht ausreichend genaue und zuverlässige Prognosefaktoren werden momentan eingesetzt, um ein erhöhtes Risiko an ernsthaften Infektionen bei Patienten, die mit Chemotherapie, Strahlenbehandlung oder anderen immunschwächenden Therapien behandelt wurden, vorherzusagen²⁴.
Dementsprechend ist es wahrscheinlich, dass Patienten, die an immunsupprimierten Zuständen leiden, welche aus einer medizinischen Behandlung hervorgehen, einem höheren Risiko unterliegen, sich anzustecken. Es ist gemäß der Erfindung möglich, eine Infektion in einem immungeschwächten Patienten vorbeugend zu behandeln bevor oder während einer Behandlung, die einen solchen Zustand erzeugt. Bei der vorbeugenden Behandlung mit MBL vor oder während einer Behandlung, die einen solchen Zustand erzeugt, ist es möglich, eine nachfolgende Infektion zu verhindern oder das Risiko des Patienten, eine Infektion wegen seines immungeschwächten Zustandes zu bekommen, zu reduzieren. Sollte der Patient eine Infektion bekommen, z. B. im Anschluss an eine Behandlung, die zu einem immungeschwächten Zustand führt, so ist es möglich, die Infektion durch die Gabe von MBL-Zusammensetzungen entsprechend der vorliegenden Erfindung zu behandeln.
Die Erfindung ist weiterhin auf die Behandlung solcher Mangelzustände durch eine MBL-Infusion gerichtet. Des Weiteren ist die Erfindung auf die Bestimmung der MBL Plasmakonzentration zur Vorhersage eines Infektionsrisikos bei einem Patienten, der sich zum Beispiel einer Chemotherapie unterzieht, gerichtet.
Gemäß einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit oder wenigstens ein Oligomer umfassend wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit einschließt, zur Herstellung eines Medikaments zur prophylaktischen, lindernden oder heilenden Behandlung einer Infektion bei einem Patienten, der anfangs einen MBL Plasmaspiegel von mehr als 50 ng/ml hat. Insbesondere kann der Patient eine genetische Veranlagung für einen MBL Mangel haben oder einen MBL Mangel erworben haben, was zu einem erhöhten Risiko an einer Infektion zu leiden führt. Dem entsprechend betrifft die Erfindung auch die Behandlung von Infektionen bei Patienten, die an einem Mangel an Mannan-bindende Lektin (MBL) leiden, eingeschlossen jegliche Mangelzustände, die auf die Produktion von MBL und/oder auf der Funktion von MBL beruhen.
In noch einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Abschätzung der Wahrscheinlichkeit eines Auftretens einer klinisch signifikanten Infektion bei einem Patienten, der sich einer Chemotherapie oder einer anderen immunschwächenden Behandlung unterzieht, bereitgestellt, wobei besagtes Verfahren die Verfahrensschritte des Messens der MBL Plasma- oder Serumkonzentration des Patienten und des Abschätzens der Wahrscheinlichkeit auf der Basis der gemessenen Konzentration umfasst.
Im vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "immungeschwächt" in seiner normalen Bedeutung verwendet, d. h. ein Individuum ist nicht in der Lage aufgrund eines primären oder sekundären Mangels eine angepasste Immunantwort, induziert oder nicht induziert, in einem oder mehreren Elementen des normalen Immunsystems auszulösen.
Bislang wurde MBL verwendet, um einen MBL-Mangel als solchen zu behandeln, wobei ein solcher Mangel definiert wurde durch einen willkürlich gewählten Spiegel von weniger als 50 ng/ml, oder häufiger weniger als 10 ng/ml Serum. Dieser Spiegel war oft mit der Sensitivität der verschiedenen MBL Test Assays identisch, sodass der Spiegel derart festgesetzt wurde, dass im Wesentlichen kein MBL mit einem der verschiedenen vorbekannten Testsysteme nachweisbar ist.
In der vorliegenden Erfindung konnte gezeigt werden, dass Infektionen im immungeschwächten Patienten verhindert und/oder behandelt werden können, unabhängig von deren MBL Serumspiegel. Insbesondere konnten Infektionen in immungeschwächten Patienten verhindert werden, wenn diesen Patienten MBL gegeben wurde und dabei der MBL-Spiegel über 50 ng/ml Serum anstieg. Auch Patienten, die einen MBL-Spiegel weit über 75 ng/ml Serum haben, können Behandlung brauchen, ebenso wie Patienten, die einen MBL-Spiegel von über 100 ng/ml Serum bzw. über 150 ng/ml Serum haben.
Die MBL-Behandlung von Infektionen kann bei solchen Patienten auch werden durch die Gabe von MBL in Verbindung mit relevanten Antibiotika, antiviralen oder fungiziden Agenzien durchgeführt werden.
Insbesondere Patienten, die ein Risiko haben, einen immungeschwächten Zustand, der aus einer medizinischen Behandlung hervorgeht, zu erwerben, werden von einer prophylaktischen Behandlung mit MBL vor, während und vielleicht auch nach der Behandlung profitieren, um Krankheiten, die mit immungeschwächten Zuständen, wie z. B. Infektionen, assoziiert sind, zu verhindern.
Grundsätzlich sollten alle Patienten, die immungeschwächt sind oder die ein Risiko haben, immungeschwächt zu werden, mit MBL behandelt werden, unabhängig von deren spezifischem MBL-Spiegel. Der Grund hierfür ist, dass Infektionen zu einer MBL-Verminderung führen können und daher ein MBL-Booster, der den MBL-Spiegel anhebt, zunächst das Risiko einer MBL-Verminderung auf einen Spiegel unter dem Mangelspiegel reduziert. Die Immunabwehr von solchen Patienten kann durch Gabe von rekombinantem oder natürlichem Plasma-MBL verstärkt werden. Insbesondere können Infektionen verhindert werden, wenn MBL Patienten, die einen MBL-Spiegel von über 50 ng/ml Serum haben, gegeben wird. Auch Patienten mit einem MBL-Spiegel von über 75 ng/ml Serum können einer Behandlung bedürfen, ebenso wie Patienten mit einem MBL-Spiegel von über 100 ng/ml Serum, oder Patienten mit einem MBL-Spiegel von über 150 ng/ml Serum.
Die Erfinder haben gezeigt, dass insbesondere Individuen, die einen MBL-Spiegel unter 500 ng/ml Serum haben, von einer MBL-Behandlung bei einem immungeschwächten Zustand profitieren. Folglich profitieren insbesondere Patienten mit einem MBL-Spiegel unter 400 ng/ml, solche Patienten mit einem MBL-Spiegel von unter 300 ng/ml, solche Patienten mit einem MBL-Spiegel von unter 250 ng/ml und solche Patienten mit einem MBL-Spiegel von unter 200 ng/ml.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einer bevorzugten Ausführungsform die Verwendung von MBL zur Herstellung eines Medikaments für Patienten, die einen MBL-Serumspiegel im Bereich von 50–500 ng/ml, sowie im Bereich von 100–500 ng/ml haben, zur Behandlung und/oder Verhinderung von Infektionen, insbesondere im Zusammenhang mit einem immungeschwächten Zustand des Patienten.
Der immungeschwächte Zustand kann durch eine medizinische Behandlung wie oben besprochen, insbesondere Chemotherapie oder andere immunsupprimierende Behandlungen wie z. B. Behandlungen mit Steroiden, Cyclophosphamid, Azathioprin, Metotrexat, Cyclosporin und/oder Rapamycin, insbesondere in Verbindung mit Krebstherapie, auftreten.
Der immungeschwächte Zustand kann auch durch eine erworbene Immunschwäche, z. B. AIDS oder Leukämie, insbesondere Neutropenie oder andere sekundäre Immundefizienzen verursacht sein.
Des weiteren werden Patienten, die einen MBL-Spiegel über 50 ng/ml und unter 500 ng/ml haben, von einer MBL-Behandlung profitieren, im allgemeinen um Infektionen zu verhindern, insbesondere chronische Infektionen.
Eine Gruppe von Patienten, die eine MBL-Behandlung bräuchte um Infektionen zu verhindern und/oder zu behandeln, sind Patienten, die einen niedrigen Spiegel an funktionellem MBL haben, unabhängig von dem MBL-Spiegel an sich. Für einige Mutationen des MBL wurde gefunden, dass, obwohl MBL-Untereinheiten und Oligomere davon im Serum exponiert sind, ihre Funktionalität niedrig war. Die Funktionalität oder funktionelle Aktivität des MBL's kann an dessen Fähigkeit, einen MBL/MASP-Komplex zu bilden, welcher zur Aktivierung des Komplementsystems führt, abgeschätzt werden. Wenn C4 von MBL/MASP gespalten wird, wird ein aktiver Thiolester exponiert und C4 wird kovalent an eine nahe nukleophile Gruppe gebunden. Ein wesentlicher Teil des C4b wird daher an die beschichtete Plastikschale („well") binden und kann von Anti-C4 Antikörpern detektiert werden.
Ein quantitatives TRIFMA für die funktionelle Aktivität von MBL wird durch 1) das Beschichten einer Mikrotiterplatte mit 1 mg Mannan in 100 ml Puffer; 2) dem Absättigen mit Tween-20; 3) dem Auftragen der zu testenden Proben, z. B. verdünnte MBL-Aufbereitungen; 4) dem Aufbringen eines MBL-freien Serums (dies führt zur Bildung von MBL/MASP-Komplexen); alternativ kann das MBL und das MBL-freie Serum vor der Anwendung in der Mikrotiterplatte gemischt werden; 5) dem Aufbringen von 5 mg/ml gereinigtem Komplementfaktor C4; 6) einer einstündige Inkubation bei 37°C; 7) dem Aufbringen eines Eu-markierten Anti-C4 Antikörpers; 8) dem Aufbringen einer Verstärkerlösung; und 9) dem Auslesen des Eu in einer zeitauflösenden Fluorometrie durchgeführt. Zwischen allen Schritten wird die Platte bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen, außer zwischen dem Schritt 8) und 9).
Eine Abschätzung mittels ELISA kann auf ähnliche Art und Weise ausgeführt werden, z. B. durch das Aufbringen eines Biotin-markierten Anti-C4 in Schritt 7); 8) dem Aufbringen von Avidin, welches mit alkalischer Phosphatase markiert ist; 9) dem Aufbringen des Substrates; und 10) dem Auslesen der Farbintensität.
Die Funktionalität kann als spezifische Aktivität von MBL ausgedrückt werden, z. B. ein Unit von MBL-Aktivität pro ng MBL. Ein nicht-funktionales MBL kann als MBL definiert werden, welches eine spezifische Aktivität von weniger als 50% der spezifischen Aktivität des Plasma-MBL's, von weniger als 25% der spezifischen Aktivität des Plasma-MBL's hat, wobei das Plasma-MBL von einem Patienten aufgereinigt wird, der an keiner MBL Mutation leidet. Insbesondere ist das Referenz-Plasma-MBL ein Plasma-Pool mit der Nummer LJ 6.57 28/04/97.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf das Vorbeugen und/oder die Behandlung von Infektionen bei Patienten, die eine Mutation in ihrem MBL-Gen haben, welche zu einer verminderten Expression von MBL und/oder der Expression von nicht-funktionellem MBL führt.
Insbesondere können solche Mutationen im MBL-Gen zu einem Austausch der Aminosäure Nummer 52 (die Nummerierung schließt die Leader-Peptide des MBL's ein) von Argenin zu Cystein, Aminosäure Nummer 54 von Glyzin zu Asparginsäure oder Aminosäure Nummer 75 vom Glyzin zu Glutaminsäure führen.
Auch Mutationen in der Promoter-Region des MBL-Gens können zu niedrigeren Spiegeln des MBL's führen. Insbesondere Mutationen an Position -221 haben einen Einfluss auf die Expression von MBL.
Die MBL-Sequenz kann in der Proteindatenbank swiss.prot unter der Zugangsnummer 11226 gefunden werden.
Die MBL-Zusammensetzung, die zur Herstellung eines MBL-Medikaments verwendet wird, kann aus jeder verfügbaren MBL-Quelle hergestellt werden. Die MBL-Quelle kann natürliches MBL sein, wobei das MBL in einem natürlichen Wirtsorganismus produziert wird. Dies bedeutet, dass MBL von Zellen, die normalerweise MBL expremieren, produziert wird. Eine übliche Methode zur Herstellung von MBL-Zusammensetzungen ist die Extraktion von MBL aus menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Serum oder Plasma. MBL kann aber auch von Hepatozytenkulturen geerntet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform werden die MBL-Oligomere durch Wirtsorganismen produziert, die normalerweise kein MBL-Polypeptid exprimieren, z. B. mittels rekombinanter Technologie.
Gemäß einer ersten Ausführungsform kann Serum die MBL-Quelle sein, von welcher eine MBL-Zusammensetzung mittels Aufreinigung durch geeignete Aufreinigungsmethoden aus Serum, Plasma, Milchprodukten, Kolostrum oder ähnlichem erhalten wird. Eine geeignete Aufreinigungsmethode ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung von Kohlenhydrat-derivatisierten Matrizen, wie Mannose oder Mannan-gekoppelten Matrizen. Eine solche Methode wird in WO 99/64453 besprochen, wobei dem Reinigungsprozess ein Virusentfernungsschritt nachfolgt, um infektiöse Agenzien aus der MBL-Quelle zu entfernen. Denn eines der Hauptprobleme mit Proteinen, die von Körperflüssigkeiten aufgereinigt werden, ist das Risiko infektiöse Agenzien zusammen mit dem gewünschten Protein zu verabreichen. WO 99/64453 wird über Zitierung in den Offenbarungsgehalt eingeschlossen.
Die MBL-Zusammensetzung zur Herstellung eines MBL-Medikaments umfasst vorzugsweise MBL-Oligomere, die eine Größenverteilung haben, welche im Wesentlichen identisch ist mit der Größenverteilung von MBL im Serum oder auch ein Größenverteilungsprofil, welches wenigstens 50% identisch ist mit dem Größenverteilungsprofil von MBL im Serum. Mit identisch ist hierbei gemeint, dass wenigstens 50% der Oligomere ein offensichtliches Molekulargewicht größer als 200 kDa haben, wenn sie in einem SDS-PAGE und/oder Western Blot analysiert werden.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Größenverteilungsprofil wenigstens 75% identisch zu dem Größenverteilungsprofil von MBL im Serum oder auch wenigstens 90% identisch zu dem Größenverteilungsprofil von MBL im Serum und weiter bevorzugt wenigstens 95% identisch zu dem Größenverteilungsprofil von MBL im Serum.
Falls aus einer MBL-Quelle aufgereinigt wird, die zunächst ein anderes Größenverteilungsprofil hat, ist es bevorzugt, dass die Affinitätschromatographie, welche verwendet wird, um aus der MBL-Quelle aufzureinigen, beim Aufreinigen Oligomere bevorzugt, die ein offensichtliches Molekulargewicht von größer als 200 kDa haben. Dies kann erreicht werden durch die Verwendung einer Kohlenhydrat-derivatisierten Matrix, die nahezu keine Affinität zu Untereinheiten und/oder MBL-Dimeren hat. Vorzugsweise hat die Kohlenhydrat-derivatisierte Matrix im Wesentlichen eine Affinität zu Tetrameren, Pentameren und/oder Hexameren des rekombinanten MBL's.
Die Matrix kann mit jedem Kohlenhydrat oder jeder Kohlenhydratmischung derivatisiert werden, an welche MBL bindet und welche die Bindung von höheren Oligomeren des MBL's bevorzugt. Die Kohlenhydrat-derivatisierte Matrix ist vorzugsweise eine Hexose-derivatisierte Matrix, z. B. eine Mannose- oder eine N-Acetyl-Glucosamin-derivatisierte Matrix, vorzugsweise eine Mannose-derivatisierte Matrix.
Die Trennschärfe der Kohlenhydrat-derivatisierten Matrix wird erhalten durch das Sicherstellen, dass die Matrix als solche insbesondere eine underivatisierte Matrix im Wesentlichen keine Affinität zu MBL-Polypeptiden, insbesondere keine Affinität zu MBL-Trimeren oder kleineren Oligomeren hat. Dies kann gewährleistet werden, wenn die Matrix als solche kohlenhydratfrei ist. Insbesondere sollte die Matrix keine Sepharose oder ähnliches enthält. Vorzugsweise besteht die Matrix aus einem kohlenhydratfreien Polymermaterial wie Fractogel^®TSK Kügelchen.
Die Matrix kann in jeder Form für die Chromatographie geeignet sein, meist jedoch in Form von Kügelchen, wie Plastikkügelchen.
Nach dem Aufbringen der MBL-Quelle wird die Säule gewaschen, vorzugsweise unter Verwendung eines nicht-denaturierenden Puffers, der eine Zusammensetzung, einen pH-Wert und eine Ionenkonzentration hat, um Proteine zu eliminieren ohne dabei jedoch die höheren Oligomere des MBL's auszuschwemmen. Ein solcher Puffer kann TBS sein. Das Ausschwemmen von MBL wird mittels eines ausgewählten desorbierendes Agens durchgeführt, welches in der Lage ist, die höheren Oligomere des MBL's effizient auszuschwemmen, z. B. TBS mit einem desorbierenden Agens wie EDTA (z. B. 5 mM EDTA) oder Mannose (z. B. 50 mM Mannose), und dem Auffangen der MBL-Oligomere. Eine solche Aufreinigungsmethode ist in einer parallelen internationalen Patentanmeldung mit dem Titel "Recombinant Human Mannan Binding Lectin", welche am selben Tag wie die vorliegende Erfindung eingereicht wurde, beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine MBL-Zusammensetzung mit klinischem Reinheitsgrad erhalten, indem die verwendete MBL-Quelle mittels rekombinanter Technologie hergestellt wird, wobei die MBL-Quelle das Kulturmedium von MBL-produzierenden Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung umfasst daher MBL, welches durch einen Prozess zur Herstellung von rekombinantem Mannan-bindenden Lektin (MBL) gewonnen wird, wobei die folgenden Schritte umfasst sind:

– Herstellen eines Gen-Expressionskonstruktes, welches eine DNA-Sequenz, die ein MBL-Polypeptid oder ein funktionelles Äquivalent desselben kodiert, umfasst;
– Transformieren einer Wirts-Zellkultur mit dem Konstrukt;
– Kultivieren der Wirts-Zellkultur, wodurch die Expression und die Sekretion des Polypeptids in das Kulturmedium erreicht wird, gefolgt von
– dem Sammeln des Kulturmediums, welches das humane rekombinante MBL umfasst.

Das Kulturmedium umfassend das humane rekombinante MBL-Polypeptid kann dann wie oben beschrieben zur Aufreinigung von MBL prozessiert werden.
Das MBL-Polypeptid ist vorzugsweise ein Säuger-MBL-Polypeptid, vorzugsweise ein menschliches MBL-Polypeptid. Das Gen-Expressionskonstrukt kann mit Standardmethoden, die der Fachmann kennt, wie z. B. beschrieben in US Patent Nr. 5,270,199, hergestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das Gen-Expressionskonstrukt hergestellt wie in der Dänischen Patentanmeldung Nr. PA 1999 00668 oder in der parallelen internationalen Patentanmeldung mit dem Titel "Recombinant Human Mannan Binding Lectin", welche am selben Tag wie die vorliegende Anmeldung eingereicht wurde, beschrieben.
Die Expression wird vorzugsweise in z. B. nicht menschlichen Säugerzellen ausgeführt. Die Herstellung entsprechend der Erfindung erfolgt durch die Verwendung eines Expressionsvektors, welcher Intron Sequenzen des MBL-Genes und wenigstens eine Exon Sequenz umfasst. Bezüglich des Begriffes der nicht-menschlichen transgenen Tiere als Expressionssystem sind in diesem Zusammenhang Tiere gemeint, welche genetisch modifiziert wurden, um ein menschliches MBL-Gen, Fragmente oder Imitate (mimics) davon zu enthalten und zu exprimieren.
Zusätzlich zu der Aufreinigungsmethode ist es bevorzugt, dass das Gen-Expressionskonstrukt und die Wirtszellen ebenso die Produktion von höheren Oligomeren favorisieren. Was dadurch erreicht werden kann, dass Gen-Expressionskonstrukte verwendet werden, welche wenigstens eine Intron-Sequenz des menschlichen MBL-Genes oder ein funktionelles Äquivalent desselben enthalten. Säugerzellen und Insektenzellen.
Die MBL-Zusammensetzung ist insbesondere für die Behandlung und/oder Prophylaxe einer Infektion, die mit einem immungeschwächten Zustand eines Patienten zusammenhängt, geeignet. Jede mikrobielle Infektion, insbesondere jede Infektion, die durch eine Mikrobienspezies ausgelöst wurde, kann mit MBL behandelt oder verhindert werden.
Folglich kann die MBL-Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Behandeln einer Infektion bei einem immungeschwächten Patienten verwendet werden, wobei die Mikrobienspezies ein Pilz, eine Hefe, eine Protozoe oder ein Bakterium ist.
Weiterhin kann die MBL-Zusammensetzung für die Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, bei welchen die Mikrobienspezies resistent gegen gewöhnliche Arzneimittel ist, z. B. Infektionen, bei denen die Bakterienspezies resistent gegen wenigstens ein Antibiotikum ist. Besonders interessant ist die Prophylaxe und/oder Behandlung einer Infektion ausgelöst durch Bakterienspezien die multiresistent sind.
Immungeschwächte Patienten können an Infektionen, die von pathogenen Bakterienspezien wie Streptococcus pneumonia, Salmonella und Staphylokokken Spezien ausgelöst sind, leiden.
Es ist jedoch auch bekannt, dass insbesondere immungeschwächte Patienten oft an Infektionen leiden, die durch Bakterienspezien ausgelöst sind, welche normalerweise nicht pathogen sind, insbesondere opportunistische Pathogene, z. B. E. coli Spezies, wobei viele dieser Spezies resistent gegen normale Antibiotikabehandlungen sind.
Eine Infektion in Verbindung mit einem immungeschwächten Zustand kann auch eine virale Infektion sein, insbesondere eine virale Infektion wobei das Virus ein Retrovirus ist.
Weiterhin kann der immungeschwächte Zustand auch eine Infektion mit dem Retrovirus Humanes Immundefizienz Virus (HIV) sein. Die viralen Infektionen, die gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt oder verhindert werden, sind normalerweise nicht durch einen Retrovirus, sondern z. B. durch ein DNA-Virus bedingt.
Zur Herstellung des Medikaments kann das Eluat, welches bei der Affinitätschromatographie erhalten wurde, als solches eingesetzt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass das Eluat weiteren Aufreinigungsschritten unterzogen wird, bevor es eingesetzt wird.
Zusätzlich zu den MBL-Oligomeren kann das Medikament eine pharmazeutisch annehmbare Trägersubstanz und/oder ein Vehikel umfassen. Insbesondere kann ein Stabilisator zugegeben werden, um das MBL-Protein zu stabilisieren. Der Stabilisator kann ein Zucker, Alkohol, Saccharide, Proteine und/oder Aminosäuren sein. Beispiele für Stabilisatoren können Maltose oder Albumin sein.
Weitere Standardzusätze können dem Medikament beigesetzt werden, z. B. in Abhängigkeit der Applikationsform. Gemäß einer Ausführungsform ist das Medikament für Injektionen geeignet. Konventionelle Trägersubstanzen wie isotonische Salzlösung können verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist das Medikament in einer Form, die für pulmonale Applikation geeignet ist, z. B. in Form eines Inhalationspuders oder einer Creme oder einer Flüssigkeit für topische Anwendungen.
Die Applikation kann über jeden geeigneten Weg erfolgen, insbesondere intravenös, intramuskulär, subkutan oder intradermal. Weiterhin sind in der vorliegenden Erfindung auch eine pulmonale oder topische Applikation ins Auge gefasst.
Die MBL-Zusammensetzung kann gleichzeitig, abwechselnd oder getrennt von anderen Behandlungen, wobei die besagten anderen Behandlungen zu einem immunsupprimierten Zustand des Patienten führen, z. B. Chemotherapie, appliziert werden. Das Medikament kann eine Zeit lang vor dem Beginn der Chemotherapie oder ähnlichem und auch während wenigstens einem Teil der Chemotherapie gegeben werden.
Die MBL-Zusammensetzung wird in geeigneten Dosen gegeben, insbesondere wird sie wiederholt in geeigneten Intervallen, wie ein bis zweimal pro Woche, gegeben. Es kann vor dem Beginn der Chemotherapie gestartet werden und zumindest während einem Teil der Chemotherapie, vorzugsweise während der ganzen Phase der Chemotherapie, Intervalle beibehalten werden, z. B. einmal pro Woche.
Normalerweise werden 1–100 mg, vorzugsweise von 2–10 mg, weiter vorzugsweise von 5–10 mg pro Dosis in Abhängigkeit des zu behandelnden Patienten beispielsweise circa. 0.1 mg/kg Körpergewicht gegeben.
Die Verwendung der MBL-Zusammensetzung kann auch in einer aus Einzelteilen bestehenden Zusammensetzung, welche ein weiteres Medikament, wie ein antifungal, anti hefe, antibakterielles und/oder antivirales Medikament, umfasst.
Das antivirale Medikament kann ein Medikament sein, welches in der Lage ist, Virus abzuschwächen und/oder zu eliminieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der MBL-Spiegelbestimmung als Vorhersagemarker über das Risiko eines Patienten eine Infektion zu erwerben und dadurch als Indikator für eine Behandlung. Insbesondere ist ein MBL-Spiegel unter 500 ng/ml ein Vorhersagemarker, der eine Behandlung mit MBL insbesondere im Zusammenhang mit einem immungeschwächten Patienten oder einem Patienten, der gefährdet ist, immungeschwächt zu werden, indiziert.
Der Vorhersagemarker kann in Bezug auf jede Infektion eingesetzt werden, ist aber besonders relevant als Vorhersagemarker für eine Septikämie oder Lungenentzündung bei Patienten, die sich einer immunschwächenden zelltoxischen Therapie unterziehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine Methode, die MBL-Zusammensetzung zum Verhindern und/oder Reduzieren von Infektionen in einem Patienten einzusetzen, wobei die Methode die Schritte umfasst:

i) Bestimmen des Serumspiegels von MBL in einem Patienten,
ii) Abschätzen der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten einer signifikanten klinischen Infektion bei einem Patienten, und gegebenenfalls
iii) Gabe einer MBL-Zusammensetzung an den Patienten.

Der MBL-Spiegel wird im Serum oder Plasma gemessen und kann mittels "Time Resolved Immunofluorescent Assay" (TRIFMA), ELISA, RIA oder Nephelometrie bestimmt werden.
Weiterhin kann der MBL-Spiegel von Genotyp-Analysen des MBL-Genes abgeleitet werden, wie es oben im Zusammenhang mit Mutationen des MBL's, die zu einer Abnahme des MBL-Spiegels führen, beschrieben wurde.
Die Erfindung wurde nun in verschiedenen Ausführungsformen und im Detail erklärt und beschrieben, sie wird zusätzlich durch die nachfolgenden 1 und 2 und die nicht-limitierenden Beispiele der bevorzugten Ausführungsformen illustriert.
Figurenbeschreibung
1: Die Verteilung der MBL-Konzentration im Plasma von Leukämiepatienten, wobei die Patienten getrennt werden in Patienten mit klinisch signifikanten Infektionen (CSI) und Patienten ohne klinisch signifikante Infektionen (Non-CSI).
2: Die Verteilung der MBL-Konzentration im Plasma von Patienten mit multiplem Myeloma, getrennt in solche mit klinisch signifikanten Infektionen (CSI) und solche ohne klinisch signifikante Infektionen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele zeigen die Ergebnisse von Untersuchungen über den Einfluss eines MBL-Mangels auf das Auftreten von klinisch signifikanten Infektionen in einer Gruppe von Patienten der Hämatologie, die sich einer Chemotherapie unterziehen.
Patientengruppe
Die Studie umfasst die Untersuchung einer konsekutiven Reihe von Patienten, die in der Abteilung für Hämatologie, Aarhus University, Dänemark, behandelt wurden. Die Mehrzahl dieser Patienten erhielt eine Chemotherapie. Es waren 7 Patienten mit Akuter Myeloider Leukämie eingeschlossen, 17 mit multiplen Myelomen (MM), 11 mit Polycytämie, 13 mit Non-Hodgkin's Lymphom, 1 mit Burkitt's Lymphom, 1 mit Waldenström's Makroglobulinämie, 5 mit Chronischer Lymphozytischer Leukämie, 3 mit Monoklonaler Gammapathieunbestimmter Signifikanz (MGUS), 5 mit Hodgkin's Lymphom, 2 mit Chronischer Myeloider Leukämie, 1 mit Akuter Lymphoider Leukämie, 1 mit Aplastischer Anämie und 1 mit Myelofibrose. Bezugnehmend auf die MM-Gruppe erhielten alle Chemotherapie. Drei verschiedene Behandlungen wurden verwendet;
VAD: Es wurden mittels fortlaufenden Infusionen über 4 Tage Vincristin (0,4 mg für 24 Stunden) und Doxorubicin (Adriamycin) (9 mg pro m² für 24 Stunden) gegeben und für 4 Tage Dexamethason (40 mg, p. o.), wobei für jeden 28-Tage-Zyklus die Gaben am Tag 1 mit 4, 9 mit 12 und 17 mit 20 gegeben wurden;
NOP: Mittels kontinuierlicher Infusionen wurden auf einmal Mitoxantron (10 mg pro m²) und Vincristin (1,4 mg pro m²) gegeben, sowie jeden Tag Prednison (2 × 50 mg, p. o.);
MP: Mittels Infusion wurde für 4 Tage Melphalan (0,25 mg/kg/Tag) und weitere 4 Tage Prednison (2 × 50 mg, p. o.) gegeben.
Patienten, bei denen sich klinisch signifikante Infektionen (CSI, definiert als Bakteriaemie oder Pneumonie) zeigten, wurden rückblickend mittels Computersuche aus einer Patientendatenbank identifiziert. Bei den MM-Patienten mit CSI hatten 4 eine pneumokokkale Lungenentzündung, 3 eine nicht spezifische Lungenentzündung und einer eine Lungenentzündung ausgelöst von Staphylococcus aureus.
Bevor die Chemotherapie begann, wurde Blut in evakuierte Glasröhrchen mit EDTA (Endkonzentration um die 10 mM) gezogen. Das Plasma wurde aliquotiert und bei –80°C bis zum Test aufbewahrt. Plasmaproben wurden auf ähnliche Weise auch von gesunden Blutspendern erhalten. Die Patienten waren infektionsfrei zum Zeitpunkt der Blutspende.
Testsystem für MBL
Die Konzentration des MBL's wurde mittels eines zeitauflösenden Immunofluoreszenz Assay (TRIFMA) bestimmt. Mikrotiterplatten (fluoroNunc, Nunc, Kamstrup, Dänemark) wurden mit Antikörpern durch Übernacht-Inkubation bei Raumtemperatur beschichtet, wobei 500 ng Antihuman MBL Antikörper (Mab 131-1, Statens Serum Institut, Kopenhagen, Dänemark) in 100 μl PBS (0,14 M NaCl, 10 mM Phosphat, pH 7,4) eingesetzt wurden. Nach einem Waschschritt mit einem Tween enthaltenden Puffer (TBS, 0,14 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, 7,5 mM NaN₃, pH 7,4 mit 0,05% Tween 20) wurden zu den Testproben (Plasma 1/20) und der Kalibrierungslösung zusätzliches TBS/Tween mit extra NaCl auf 0,5 M und 10 mM EDTA gegeben.
Nach einer Übernacht-Inkubation bei 4°C und einem Waschschritt wurde zum Entwickeln der Europium-markierte Antikörper (12,5 ng Mab 131-1 markiert mit dem Eu-enthaltenden Chelat, Isothiocyanato-benzoyl-diethylen-triamin-tetra Essigsäure, gemäß den Angaben des Herstellers Wallac, Turku, Finnland) in TBS/Tween mit 25 μM EDTA zugegeben.
Im Anschluss an eine zweistündige Inkubationszeit und einen Waschschritt wurde die Fluoreszenz-verstärkende Lösung (Wallac) zugegeben und die Platten in einem zeitauflösenden Fluorometer ausgelesen (Delfia 1232, Wallac). Die Eichkurve wurde mittels einer Plasmaverdünnung, die aliquotiert bei –80°C aufbewahrt wurde, gemacht. Die Konzentration des MBL's in diesem Plasma (3,6 μg/ml) wurde durch den Vergleich mit hoch aufgereinigtem MBL, welches mittels einer quantitativen Aminosäureanalyse quantifiziert wurde, bestimmt.
Ergebnisse
Es konnte kein Unterschied in der Anzahl der Personen mit MBL-Mangel zwischen hämatologischen Patienten und normalen Personen gefunden werden.
Ein signifikant niederer Spiegel von MBL wurde in hämatologischen Patienten mit CSI im Vergleich zu Patienten ohne CSI (1) beobachtet. Wenn die Gruppe der Patienten mit MM unter sich analysiert wurde, wurde ein niedrigerer MBL-Spiegel bei den Patienten mit CSI beobachtet (2).
Diskussion
Bislang wurden Untersuchungen über den Zusammenhang zwischen MBL-Mangel und einer Infektionshäufigkeit durchgeführt indem ein willkürlicher Spiegel für den Mangel (z. B. 50 ng/ml¹⁸) festgelegt wurde oder indem das Vorliegen von mutierten Allelen von MBL auf beiden Chromosomen als Anzeichen für einen Mangel^11,12 verwendet wurde. In der vorliegenden Studie definieren die Patienten selber den Spiegel bei dem klinische Symptome offensichtlich werden als unter 500 ng MBL pro ml. In anderen Patientengruppen kann sich der Spiegel als unterschiedlich herausstellen, da die unterschiedlichen immunologischen Parameter einen variablen Stellenwert in verschiedenen Patientengruppen haben.
Die Ergebnisse in 1 und 2 zeigen, dass Patienten mit einer MBL-Plasmakonzentration von unter 500 ng/ml deutlich anfälliger für Infektionen im Anschluss an eine Chemotherapie sind. Dieser Gruppe von Patienten sollte eine Ergänzungstherapie mit MBL während der chemotherapeutischen Behandlung angeboten werden. Die Behandlung kann vor dem Beginn der Chemotherapie beginnen und fortgesetzt werden bis die übrigen immunologischen Parameter sich normalisiert haben. Das MBL kann von menschlichem Plasma aufgereinigt werden oder mittels rekombinanter Technologien hergestellt werden.
Selbstredend kann man voraussagen, dass Patienten mit anderen Krebsformen, die sich einer zytotoxischen Behandlung unterziehen (Chemotherapie oder Röntgentherapie) ebenfalls von einer Behandlung mit MBL profitieren sollten.
Unpublizierte Ergebnisse haben gezeigt, dass die MBL-Konzentration im Anschluss an eine Septikämie abnimmt und daher könnte sich die Behandlung mit MBL als nützliche Modalität in Patienten erweisen, um zunächst normale Spiegel von MBL zu erreichen.
Die Überlebensdauer von Patienten mit MM reicht von wenigen Monaten bis zu vielen Jahren. Beachtliche Anstrengungen sind unternommen worden um Vorhersageparameter für das Überleben von Krebspatienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen, zu definieren.
Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass die MBL-Konzentration ein zuverlässiger Parameter für eine Sepsis nach einer Chemotherapie ist. Das Messen der MBL-Konzentration ist daher ein wichtiger Vorhersageparameter in Patienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen und es kann angenommen werden, dass es sich ähnlich in Patienten, die andere zytotoxische Behandlungen erhalten, verhält. Da der Genotyp des MBL-Genes die Plasmakonzentration von MBL bestimmt, kann eine Analyse der MBL-Gene in einem Patienten indirekt zur Abschätzung der MBL-Konzentration verwendet werden.
In der Literatur sind zwei Studien über die Messung von MBL in Krebspatienten beschrieben. Aittoniemi et al. untersuchte Patienten mit chronischer lymphozytischer Leukämie (CLL) bezüglich eines Zusammenhangs zwischen MBL-Mangel und Infektionen²⁵. Nur sechs von 28 Patienten erhielten eine Chemotherapie, wobei drei Patienten mit Chlorambucil-[Prednisolon] und drei Patienten mit Chlorambucil-[Prednisolon] und Cyclophosphamid-(hydroxydaunorubicin)-Oncovin-Prednisolon behandelt wurden. Der MBL-Mangel wurde als eine MBL-Konzentration unter der Nachweisgrenze (< 20 ng/ml) des MBL-Assays definiert. Aus der Gruppe mit 28 Patienten wurde nur einer in die Gruppe der MBL-Mangel Patienten eingeschlossen.
Es wurden keine Versuche angestellt um herauszufinden, ob eine Verbindung zwischen dem MBL-Spiegel und der Infektionsrate in Patienten, die eine Chemotherapie erhalten hatten, vorliegt. Daher kann keine Schlussfolgerung bezüglich der Ansprüche der vorliegenden Patentanmeldung aus dieser Studie gezogen werden.
Lehrnbecher et al. untersuchten ob der Spiegel von Interleukin-6, Interleukin-8, C-reaktivem Protein, löslichem Fc Gamma-Rezeptor Typ III, oder MBL als Indikator für ernsthafte Infektionen in fiebrigen Kindern mit Krebs oder Neutropenie²⁶ dienen kann. Eine Gruppe von insgesamt 56 Kindern mit bestätigten bösartigen Tumoren und einer Chemotherapie-induzierten Neutropenie wurden untersucht. Die gemessenen MBL-Spiegel waren nicht dargestellt in der Veröffentlichung. Es wurde nur im Text angedeutet, dass "der MBL-Spiegel nicht geeignet war, um zwischen lebensbedrohenden Infektionen und febrilen Episoden ohne identifizierbare Quelle oder auch möglichen Katheter-bedingten Bakteriaemien zu unterscheiden".
Die Studiengruppe dieser Untersuchung unterscheidet sich von derjenigen die für die vorliegende Erfindung präsentiert wurde, da es alles Kinder waren und 27 der Kinder aufgrund eines kompakten Tumors und nicht wegen Leukämie eingeschlossen waren. Die verbleibenden 29 Leukämiepatienten wurden nicht untereinander analysiert. Ohne die entsprechenden Daten ist es nicht möglich, diese Studie mit den hier vorgetragenen Ergebnissen zu vergleichen.
Weitere biologische oder immunmodulierende Agenzien wurden in der Behandlung von Patienten mit Neutropenie und Fieber eingesetzt. Intravenös verabreichtes Immunoglobulin hatte keinen Effekt bezüglich einem Verhindern von Fieber oder Infektion in Patienten mit Neutropenie, mag jedoch einen abgemilderten Effekt in Patienten mit einem Antikörpermangel haben. Interferon-Gamma kann für Patienten mit einigen neutrophilen Mangelerscheinungen Erleichterung bringen, dies ist jedoch nicht abschließend bewiesen. Zelluläre Wachstumsfaktoren (Granulozyten und Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor) kann die Dauer einer Neutropenie und damit den Bedarf an Antibiotika verringern.
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Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit oder wenigstens ein Mannan-bindendes Lektin (MBL) Oligomer mit wenigstens einer Mannan-bindenden Lektin (MBL) Untereinheit umfasst für die Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe und/oder zur Behandlung von Infektionen eines Individuums, welches ein MBL-Serumlevel von über 50 ng/ml Serum hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung wenigstens ein Mannan-bindendes Lektin (MBL) Oligomer umfasst, welches wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit enthält.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei besagtes Oligomer vorzugsweise aus der Gruppe von Oligomeren ausgewählt ist, die aus Tetrameren, Pentameren und/oder Hexameren besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Individuum einen immungeschwächten Zustand hat.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei besagter immungeschwächter Zustand Neutropenie ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Infektion eine Infektion ist, die durch Mikroben bedingt ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Mikrobenspezies ein Pilz ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Mikrobenspezies Hefe ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Mikrobenspezies ein Bakterium ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die Bakterienspezies pathogen ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Infektion eine vitale Infektion ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die MBL-Untereinheit oder das MBL-Oligomer in einem natürlichen Wirtsorganismus produziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die MBL-Untereinheit oder das MBL-Oligomer von einem nicht-menschlichen Wirtsorganismus, der natürlicherweise kein MBL-Polypeptid exprimiert, produziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die MBL-Untereinheit oder das MBL-Oligomer durch eine Methode, welche wenigstens einen in vitro Schritt einer rekombinanten DNA Technologie umfasst, produziert wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei die Produktion der MBL-Untereinheit oder des MBL-Oligomers durch eine expressionskontrollierende Sequenz, die natürlicherweise nicht mit der MBL-Polypeptid Expression assoziiert ist, kontrolliert wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei die MBL-Untereinheit oder das MBL-Oligomer mittels einer Methode, die wenigstens einen Schritt, der eine Affinitätschromatographie involviert umfasst, isoliert wird.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei der Affinitätschromatographieschritt in der Lage ist MBL Tetramere, Pentamere und/oder Hexamere aus einer Zusammensetzung, die zusätzlich MBL-Oligomere oder MBL-Untereinheiten enthält, zu isolieren.
Verwendung gemäß der Ansprüche 13 bis 17, wobei die MBL-Untereinheit und/oder das MBL-Oligomer frei von jeglichen Verunreinigungen ist, die normalerweise mit MBL assoziiert sind, wenn dieses in einem natürlichem Wirtsorganismus produziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die MBL-Untereinheit eine aus Säugern stammende MBL Untereinheit ist.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Säuger MBL-Untereinheit eine menschliche MBL Untereinheit ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Individuum ein MBL-Serumlevel von unter 500 ng/ml hat.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 21, wobei der MBL-Serumlevel in dem Individuum durch quantitative Analysen bestimmt worden ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit, oder wenigstens ein Mannan-bindendes Lektin (MBL) Oligomer mit wenigstens einer Mannan-bindenden Lektin (MBL) Untereinheit umfasst und eines antimikrobischen Medikaments für die Herstellung eines aus Einzelbestandteilen zusammengesetztes Medikament, wobei besagtes aus Einzelbestandteilen zusammengesetztes Medikament wenigstens eine Mannan-bindende Lektin (MBL) Untereinheit oder wenigstens ein Mannan-bindendes Lektin (MBL) Oligomer umfassend wenigstens eine Mannan-bindende Untereinheit und das antimikrobische Medikament enthält, für die Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen eines Individuums, welches ein MBL-Serumlevel von über 50 ng/ml Serum hat.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei das antimikrobische Medikament ein antibakterielles Medikament ist.